膜突蛋白磷酸化在大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的作用机制探讨.PDF

中华危重病急救医学 20 17 年 9 月第 29 卷第 9 期 Chin Crit Care Med ，September 20 17 ，Vol.29 ，No.9 · 825 · ·论著 · 膜突蛋 白磷酸化在大鼠肺微血管 内皮细胞 损伤 中的作用机制探讨 ， 230022 ： ， ： Email sungengy@126.com DOI ：10.3760/cma.j .issn.2095-4352.20 17.09.0 12 【 】 摘要 目的 观察肿瘤坏死 因子 - α（TNF- α）诱导大 鼠肺微血管 内皮细胞 （PMVECs ）损伤 中膜突蛋 白（Moesin ）磷酸化水平 的变化 ，探讨 Rac1 信号通路对 Moesin 磷酸化 的影 响。方法 体外培养大 鼠 PMVECs 并传至第 3 代 ，分别进行 TNF- α 时效实验 、量效实验 以及 Rac1 信号通路干预实验 。① 时效实验 ：以 10 μg/L TNF- α分别刺激大 鼠 PMVECs 0 、15、30 min 和 1、3、6、12 h 后 ，采用蛋 白质免疫 印迹试验 （Western Blot ）检 测 Moesin 和磷酸化 Moesin （p-Moesin ）的蛋 白表达 。② 量效实验 ：分别 以 0 、0.1、1、10 μg/L TNF- α刺激大 鼠 PMVECs 6 h 后 ，采用 Western Blot 检测 Moesin 和 p-Moesin 的蛋 白表达 。③ Rac1 信号通路 干预实验 ：在 PMVECs 细胞 中分别给予 3 mL 200 μmol/L 的 Rac1 特异性抑制剂 NSC23766 预孵 0.5 h 或 200 μmol/L 的 Rac1 特 异性激动剂 O-Me-cAMP 预孵 1 h ，再分别与 10 μg/L 的TNF- α共孵育 6 h ；同时设立空 白对照组及 O-Me-cAMP 、 NSC23766、TNF- α单独处理组 ；采用 Western Blot 检测 Moesin 和 p-Moesin 的蛋 白表达 。结果 ① 时效实验结 果 ：以 10 μg/L TNF- α与大 鼠 PMVECs 共孵育后各时间点 Moesin 表达量无 明显变化 ；而 TNF- α诱导 15 min 时 ，p-Moesin 表 达 量 即 较 0 min 迅 速 升 高 （p-Moesin/Moesin ：4.399 ±0.523 比 1.000 ±0.195 ），30 min 达 高 峰 （6.069 ±0.557 ），1 h 后逐渐下降 （1、3、6、12 h 分别为 5.005 ±0.544 、4.599 ±0.478、1.742 ±0.288、1.503 ±0.352 ）， 各时间点间差异有统计学意义 （F ＝15.397 ，P ＝0.002 ）。② 量效实验结果 ：各剂量 TNF- α与大 鼠 PMVECs 共 孵 育 6 h 时 Moesin 表达量无 明显变化 ；而 以 0.1 μg/L TNF- α诱 导 的 p-Moesin 表达量 即较 0 μg/L 显著升高 （p-Moesin/Moesin ：2.194 ±0.430 比 1.000 ±0.273 ），且随 TNF- α剂量增加呈持续升高趋势 （1 μg/L 和 10 μg/L 分 别为 3.20 1 ±0.688、4.4 13 ±0.296 ），各剂量组间差异有统计学意义 （F ＝92.513 ， P ＜0.00 1）。③ Rac1 信号通路干 预实验结果 ：各组间 Moesin 表达量无 明显差异 。与空 白对照组 比较 ，Rac1 特异性激动剂 O-Me-cAMP 或 Rac1 特异性抑制剂 NSC23766 单独刺激均不能改变 p-Moesin 表达 ；而 TNF- α可诱