获得目的基因2形成重组DNA分子3.PPTVIP

（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱 基序列是否有专一性要求？ 。 （4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的 细菌B通常为 。 否 农杆菌 （5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。 ①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DNA片断。 ②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DNA片断。 2 1 一 原核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 调控遗传信息的表达 (调控序列) 编码蛋白质 (编码序列) 一 原核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA 一 原核细胞的基因结构 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶 A G G T C A C G T C G T C C A G T G C A G C 一 原核细胞的基因结构 与RNA聚合酶结合位点 A G G T C A C G T C G T C C A G T G C A G C RNA聚合酶 A G G U C A C G U C G 一 原核细胞的基因结构 与RNA聚合酶结合位点 A G G T C A C G T C G T C C A G T G C A G C A G G U C A C G U C G 二 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区下游 调控遗传信息的表达 (调控序列) 外显子 (能编码蛋白质) 内含子 (不能编码蛋白质) 1.2基因工程的基本操作步骤 1、获得目的基因 2、形成重组DNA分子 3、将重组DNA分子导入受体细胞 4、筛选含有目的基因的受体细胞 5、目的基因的表达 一、获得目的基因 从基因文库中寻找 聚合酶链式反应（PCR）扩增 化学合成法 目的基因的核苷酸序列未知 目的基因的核苷酸序列已知 基因组文库 部分基因文库 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因 利用PCR提取目的基因 PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 原理：DNA双链复制 原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 前提: 已知目的基因的脱氧核苷酸序列 方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后DNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。 指数增长 归纳 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR反应 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 从基因文库中