医学常见的激光共聚焦显微镜原理.pptVIP

激光共聚焦显微镜原理和应用 激光扫描共聚焦显微镜 LSCMLaser scanning confocal microscope 以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成平行光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。 发展历史 1957年，Malwin Minsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技术的基本工作原理， 1967年，Egger第一次成功能共聚焦显微镜产生了一个光学横断面， 1970年，Sheppard和Wilson 推出第一台单光束共聚集激光扫描显微镜 1987年，White 和Amos在Nature杂志发表了“Confocal microscopy come of age”,标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。 普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜图像的差别 激光共聚焦显微镜的基本原理 利用放置在光源后的照明针孔(P1)和放置在检测器前的探测针孔(P2)实现点照明和点探测；激光经过照明针孔形成点光源，由物镜聚焦在样品焦面的某个点上，只有该点所发射 的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光线被探测器阻挡，不能到达PMT探测器，从而提高了成像效果。照明针孔和探测针孔 共焦，共焦点为被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。 LSCM的基本组成 激光发射器 显微镜部分 扫描装置 计算机系统 基本结构——激光光源 LASER “Light amplification by stimulated emission of radiation” 受激发射的辐射光放大。 激光光源的产生 受激吸收：处于较低能级的粒子在受到外界的激发（即与其他的粒子发生了有能量交换的相互作用，如与光子发生非弹性碰撞），吸收了能量时，跃迁到与此能量相对应的较高能级。 自发辐射 ：粒子受到激发而进入的激发态，不是粒子的稳定状态，自发地从高能级激发态（E2）向低能级（E1）跃迁，同时产生光辐射的过程。 众多原子以自发辐射发出的光，不具有相位、偏振态、传播方向上的一致，是物理上所说的非相干光。 受激辐射：除自发辐射外，处于高能级E2上的粒子还可以另一方式跃迁到较低能级。当一个外来光子带来的能量正好对应能级差时（E2-E1），也会引发粒子以一定的概率，迅速地从能级E2跃迁到能级E1，同时辐射一个与外来光子频率、相位、偏振态以及传播方向都相同的光子的过程。 激光光源的产生 单色性好 方向性好 亮度高 相干和偏振性好 激光的特征 激光就是受激幅射产生的，激光束里处于相同状态的光子是相干的，偏振的，并沿同一方向传播的。 激光器：405，440，635，488，559 扫描器系统 针孔：confocal一个重要组成部分，它是放在检测器及激光光源前面的一个小孔，作用是控制光切片的厚度，对实现断层扫描成像，排除焦面杂散光起关键作用 分光镜：作用是按照波长来改变光线的传播方向。 发射荧光分色镜：作用是选择出一定的波长范围的光进行检测，不同型号的仪器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由滤光片、棱镜和光栅三种类型。 检测器：采用高灵敏度的光电倍增管，其检测的范围和灵敏度可根据强度进行连续调节。 荧光显微镜系统 类型：正置，倒置 光路： 光源：汞灯、氙灯，观察分辨样品中产生荧光物质的成分与位置。 源发滤光片：选择适合荧光物质激发波波长的范围 双色分光镜：初步分开激发和发射光组件、 阻滤片：获得更纯的发射荧光 物镜：激发和发射都由同一物镜实现。 目镜：10 × 用于LSCM的荧光显微镜：侧面有扫描器接口，装有微量步进马达，有防振装置，有光路转换装置，配高数值孔径的物镜。 计算机系统 数据采集、处理、转换、应用软件 基本功能 多种图像扫描方式 2D: xy，xz，xt 3D：XYZ，Xyt 4D：XYZt 光谱扫描 多色荧光同时检测： 图像分析与定量处理： 3D重建，立体重建，断面轮廓分析。 图像分析：特定区域的强度、周长的测量，以及延时观察分析t等。 荧光光谱拆分 组织和细胞中的荧光来源 自发荧光：指组织细胞不经过任何荧光染色便能在短波长光的激发下发射出的荧光，GFP就具有自发荧光，是标记靶蛋白的特异性荧光探针。 荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态