人组织激肽释放酶6原核表达载体的构建与抗体制备.pdfVIP

人组织激肽释放酶6原核表达载体的构建及抗体制备 研究生：张华 专业：免疫学 导师：胡成进教授 中文摘要 目的 组织型激肽释放酶6(human 有胰蛋白酶样活性，与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、中枢神经系统疾病密切相关。 其研究目的在于构建hK6原核表达载体并制备高效价、高特异度的多克隆抗体和单 克隆抗体，为建立检测方法检测组织和体液中hK6奠定基础。 方法 I、Xho pMD．19T克隆载体SacI位点，经菌落PCR、双酶切鉴定和基因测序后确定 入pET-28b原核表达载体的多克隆位点，转化大肠杆菌BL21，筛选出阳性菌落后， IPTG诱导表达hK6融合蛋白，对诱导时间、温度进行优化并确定蛋白表达形式，扩 大培养，大量表达蛋白，进行镍柱纯化、SDS—PAGE及western．blot检测。 2、纯化hK6融合蛋白与弗氏佐剂等体积混合，乳化均匀后，免疫新西兰大白兔 和BALB／c小鼠，每10天加强免疫一次，四次免疫后抗体效价达峰值，对新西兰大 白兔进行心脏采血，分离出血清，．80℃冰箱保存