PCR扩增反应体系-西北农林科技大学农学院.PPT

* * * * * * * * * * * * 种子检验学实验 马守才 博士/副教授 西北农林科技大学农学院 Email:mashoucai@nwsuaf.edu.cn 种子检验学 实验四 品种真实性的SSR分子标记分析 一、目的要求 (1)通过实验操作或现场参观了解品种真实性SSR分子标记分析的基本仪器设备、引物和步骤。 (2)学会识别分子标记电泳图谱或照片图谱，能识别和判断品种图谱的差异。 * 二、实验原理 简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)分布于小麦基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位数目及序列可能不同。由于每个重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可以根据两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的电场作用下，由于分子量大小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。 * 由于不同品种的遗传组成不同，所以根据引物DNA序列存在差异或引物结合部位之间的DNA片段大小存在差异，即可鉴定小麦品种。 * 三、材料和用具 （见实验过程） 四、方法和步骤 (一) 种子或幼苗DNA提取纯化 1.CTAB法 2.SDS法 3.试剂盒法 * （二）PCR扩增 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积（10?L） 8× ddH2O（?L） － － 3.05 24.4 10×Buffer （不含Mg2+） 10× 1× 1.0 8 MgCl2(mmol/L) 25 1.25 0.5 4 dNTPs(mmol/L) 10 0.2 0.2 1.6 Tag酶U/?L 2 0.05 U 0.25 2 引物(?mol/L) 1.25 0.25 2.0 16 DNA(ng/L) 50 15 3.0 PCR扩增反应体系 PCR扩增反应体系 * 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积（15?L） 10× ddH2O（?L） － － 4.5 MIX 2 0.05 U 7.5 引物(?mol/L) 1.25 0.25 2.0 DNA(ng/L) 50 15 1.0 PCR扩增反应体系 简化PCR扩增反应体系 * 反应程序 预变性：94℃ 5min； 变 性：94℃30s， 退 火：50-68℃（依据引物的退火温度改变） 45s， 延 伸：72℃60s，进行30次循环； 终延伸：72℃ 10min。 扩增产物于4℃保存 * （三）扩增产物分离变性PAGE垂直板电泳 PCR扩增反应体系 1.制胶 玻璃板反复擦洗干净，再用双蒸水、75%乙醇分别擦洗两遍。 1mL亲和硅烷工作液，均匀涂在长玻璃板上；将1mL剥离硅烷工作液，均匀涂在带凹槽的短玻璃板上。（防止相互污染） 玻璃板彻底干燥后，将0.4mm 厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧，盖上凹槽短玻璃板，夹子固定； * PCR扩增反应体系 取80mL 6%聚丙烯酰胺变性凝胶溶液，加入60?LTEMED、180?L 10%过硫酸铵，轻轻摇匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过程应防止气泡出现。 待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿梳的平齐端插入胶液约5 mm～6 mm，胶聚合时间不少于1.5h。 胶聚合后,清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子,用清水洗干净备用。 * PCR扩增反应体系 2.变性 取10?l扩增产物，加入2?L 6×加样缓冲液，混匀。 在PCR扩增仪上运行95℃变性5min， 取出立即置于冰上，冷却10min以上后供备用。 * PCR扩增反应体系 3.电泳 将胶板安装于电泳槽上， 电泳正极槽（下槽）加入0.5×TBE缓冲液600mL，负极槽（上槽）加入0.5×TBE缓冲液600mL，拔出样品梳; 在1800V恒压预电泳（10～20）min，用塑料滴管清除加样槽孔气泡和杂质，将样品梳插入胶中1mm-2mm。 每一个加样孔加入5?L变性样品，在1800V恒压下电泳。 * PCR扩增反应体系 4.染色 将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入“固定/染色液”中，轻摇染色槽，使“固定/染色液”均匀覆盖胶板，染色5 min～10 min。 将胶板移入水中漂洗30 s～60 s。 再移入显影液中，轻摇显影液槽，使显影液均匀覆盖胶板，待带型清晰， 将胶板移入去离子水中漂洗5 min，晾干胶板，放在胶片观察灯上观察记录结果，拍照保存。 * PCR扩增反应体系 4.数据分析 扩增片段大小的读取，统一采用两段式数据记录方式。 纯合位点数据记录为X/X，小片段数据在前，大片段数据在后，缺失位点数据记录为0/0。 注：非纯合SSR位点的数据记录为X/Y（其中