- 1、本文档共12页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
Western Blot流程(自CST网站及《精编分子生物学实验指南》).doc
HYPERLINK \l 书签4 基本原理、分类
流程:( HYPERLINK \l 书签1 自CST网站)
流程:( HYPERLINK \l 书签2 自《精编分子生物学实验指南》)
Western Blot是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体进行检测。对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测
Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。
原理
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种:
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。
[编辑本段]其他
值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了。
HYPERLINK \l 书签3 返回
Western Immunoblotting Protocol (Primary Ab Incubation In BSA) 录自CST网站
For Western blots, incubate membrane with diluted antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween-20 at 4°C with gentle shaking, overnight. HYPERLINK \l 书签3 返回
Products available from Cell Signaling Technology are linked by their respective catalog numbers.
A. Solutions and Reagents
NOTE: Prepare solutions with Milli-Q or equivalently purified water.
1X Phosphate Buffered Saline (PBS).
1X SDS Sample Buffer: ( HYPERLINK /products/7722.html #7722, HYPERLINK /products/7723.html #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25°C), 2% w/v SDS, 10% glycerol, 50 mM DTT, 0.01% w/v bromophenol blue or phenol red.
Transfer Buffer: 25 mM Tris base, 0.2 M glycine, 20% methanol (pH 8.5).
10X Tris Buffe
您可能关注的文档
最近下载
- 英语搞笑短剧剧本(6角色).docx VIP
- 实验班提优大考卷二年级上册语文人教版.pdf
- 小数乘除法竖式计算题500道及答案.docx VIP
- 655-诊断学与病理学-扬州大学2023年硕士研究生初试试卷.doc VIP
- 扬州大学 655诊断学与病理学 2021年考研真题.pdf VIP
- 非煤矿山标准化操作规程.pdf
- XAQ06 工程线施工安全监理实施细则(和若铁路J4标)2020.9.17.pdf
- 外研版英语 八年级上册 Module 5 Lao She Teahouse 单元整体教学设计.docx
- QC成果提高钢结构厂房防火涂料施工质量.ppt
- ninebot九号电动滑板车MaxG2说明书用户手册.pdf
文档评论(0)