放疗热疗放疗西妥昔单抗比较-CMTTC医学继续教育项目.PPT

荧光双标 * 荧光双标 * 荧光双标 * 荧光双标 * 荧光双标 * 西妥昔单抗联合热疗与放疗诱导人鼻咽癌细胞株CNE凋亡实验研究 麻发强 黄勇攀 贵阳医学院第二附属医院 贵阳医学院 西妥昔单抗(Cetuximab) 是一种特异性针对EGFR的单克隆抗体，与EGFR结合可阻断其自身受体相关激酶的活化与磷酸化以及有丝分裂信号的下传，抑制肿瘤细胞的增殖、生长和诱导凋亡。 前 言 2006年美国FDA批准C225作为二线方案治疗失败的晚期头颈部鳞癌。但对鼻咽癌治疗中的作用还需要进一步的探讨。 本实验主要研究西妥昔单抗联合热疗与放疗诱导人鼻咽癌细胞株凋亡的效果和可能的机制。 前 言 一、材料与方法 细胞培养 人鼻咽癌细胞株CNE购于中国科学院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中培养48h，37℃恒温，5％CO2, 95％湿度环境中传代培养。 试验分组 细胞胞培养48h后随机组；先加入工作浓度（10μg/ml）的西妥昔单抗0.5μl，48h后照射，放疗12Gy照射剂量。再行43℃热疗30min，后37℃继续培养24小时和48小时。 实验分组 Hochest 33258荧光染色法观察细胞凋亡 将干净无菌的盖玻片置于30mm2培养皿，接种细胞过夜；当50%～80%满时，同前述处理；24h后吸尽培养液，PBS洗两遍；固定液固定后用Hochest33258(5mg/L)染色；双蒸水冲洗，封片；荧光显微镜下观察并随机拍照。 流式细胞术检测各组CNE的凋亡率 取对数生长期的CNE细胞，每25cm2的培养瓶接种2×106个细胞，每组设3个平行样本，分别经规定的处理因素处理后，消化收集细胞，用 Binding 缓冲液 400μl重悬，调整细胞密度为 1×106/ml；加入5μl Annexin V-FITC，混匀，4℃避光孵育15min；加入10μlPI染液（20μg/ml），4℃避光孵育 5min 后上流式细胞仪检测，继续培养24h和48h后应用流式细胞仪检测细胞凋亡。 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表达 加含PMSF裂解液冰上裂解30min提取蛋白，4℃ 12000rpm离心5min，取上清，蛋白定量后调整至浓度相同，95℃变性5min，8%聚丙烯胺凝胶电泳2h，后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h。 一抗（分别为1：200稀释的Bax、Bcl-2、β-actin抗体)4℃过夜，TBST洗膜3次（每次5min）。 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表达 二抗(1：500稀释羊抗鼠IgG-AP)室温孵育1h，TBST洗膜3次（每次5min），AP显色，运用图像分析仪对结果进行图像分析，计算条带的积分吸光度，以Actin水平作为等量蛋白上样参照。 Bax和Bcl-2蛋白的测定，每组重复四次，以均值代表测定结果。 统计学方法 实验结果用SPSS16.0 统计软件分析，结果以均值±标准差(mean± S.D)表示，两组间比较采用配对资料t检验；多组间比较采用单因素方差分析Student-Newman-Keuls检验。P0.05表示差异有统计学意义。 二、结 果 结 果 1、荧光染色法观察细胞凋亡形态学改变（×400） A:对照组 B：单纯放疗组 b C:放疗+热疗组 D:放疗+西妥昔单抗 E:放疗+热疗+西妥昔单抗 2、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率结果 联合应用AnnexinV-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，AnnexinV(-)/PI(-)代表健康活细胞，AnnexinV(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，AnnexinV(+)/PI(+)代表晚期凋亡和坏死细胞。 本实验经处理后，主要观察AnnexinV(+)/PI(-)的早期凋亡细胞。 2、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率结果 A：对照组 B：单纯放疗组 C：放疗+热疗组 D：放疗+西妥昔单抗组 E：放疗+热疗+西妥昔单抗组 2、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率结果 #表示与对照组比较，P＜0.05； ※表示与单放组、放+热组、放+西组比较，P＜0.01；＊表示与24h比较，P＜0.05 时间 分组 对照组（%） 单纯放疗照组（%） 放疗+热疗组（%） 放疗+西妥昔单抗组（%） 放疗+热疗+西妥昔单抗组（%） 24h