微生物种群定.pptVIP

酿酒微生物种群----茅台为例 地区环境主要微生物：约147种，细菌53种、酵母11种、霉菌49种、放线菌34种。主要细菌：肠杆菌、球菌、链球菌、黄杆菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌；霉菌：青霉、绿霉、黄曲霉、毛霉、梨头霉、根霉、曲霉、红曲霉等。 发酵过程微生物：97种微生物。其中，细菌40种、酵母18种、霉菌35种、放线菌有4种。其细菌主要是枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等，酵母主要是酒精酵母、假丝酵母、丝孢酵母、汉逊酵母、异常汉逊酵母、毕赤酵母等，霉菌主要为温特曲霉、紫红曲霉、红色红曲霉 。 不同酒发酵微生物区别 种群比例和数量的区别； 各微生物种类生长曲线的差异； 少数微生物种类的差异，如：嗜热芽孢菌 RT-PCR一次提取DNA检测多个指标 种群及数量----稠酒 米根霉 CT = 20.3 毛霉 CT = 22.8 酵母 CT = 17.1 枯草 CT = 18.7 对照 CT = 21.3 种群生长曲线----太白上中层酒醅 4d：酵母菌、霉菌、放线菌增殖迅速； 7d：芽孢菌急剧增殖，酵母菌、霉菌减少； 18：酵母菌、霉菌均急剧减少，芽孢菌继续增加 种群比较----茅台和汾酒 1. 汾酒和茅台中均能分离到大量地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、 嗜热芽孢杆菌、乳酸菌 2. 茅台中耐高温的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌， 以及其它耐高温的乳酸菌数量很高 优良微生物筛选鉴定和改良 未知和优良品种鉴定 鉴定手段 菌种改良 改良应用 啤酒：ā-乙酰乳酸脱羧酶酵母工程菌； 红酒：降解H2S工程菌 ……… 技术组合 功能 微生物鉴定； 定量； 种群比例； 比例动态变化； 优良菌种筛查； 菌种改良； * 样本来源 * 特异性—SC上的数据 微生物鉴定的目标 是什麽种属？ 样本中有无目标微生物？ 目标微生物定量； 种群比例； 微生物亚型； 菌群中各种微生物比例变化； 菌种改良 微生物鉴定的技术发展 形态和培养； 生理生化：营养、代谢、酶谱等； 免疫学：血清学、胶体金、ELISA; 细胞壁成份：脂肪酸等； DNA杂交； PCR、RFLP、RAPID、AFLP、PFGE等； 测序技术； 实时定量PCR技术； 芯片技术、质谱等 传统方法----1形态和培养 优点： 缺点： 1.简便； 1.时间很长；2.能够鉴别的种类很少； 2.简单计数； 3.依靠经验；4.大致分类； 传统方法----2 生理生化 营养：碳源、氮源利用；糖酵解、淀粉水解、明胶水解等 代谢：显色反应；V-P，甲基红、吲哚、H2S等； 酶：酶谱分析； 传统方法----2 生理生化----设备 传统方法----3 免疫学 传统方法----4 细胞壁组份MIDI 传统方法的流程 取样 富集 单菌落 初分类 鉴定 相似性分析 选择鉴 定板 传统方法的缺陷 流程相对复杂，耗时长，3天以上； 每次鉴定一个细菌； 必须是单菌落，不能直接做混合样本； 相似性分析，鉴定不够准确，无法到种、亚种； 成本高，尤其是做种群； 无定量，无法做种群比例变化； 可鉴定钟内少，约3000种； 分子鉴定 基因组DNA多态性；PCR, RAPID-PCR, RFLP,AFLP,PFGE rRNA操纵子分析：指纹图谱、定量PCR、测序 分子鉴定----基因组多态性 PFGE AFLP RAPID 分子鉴定----基因组多态性设备 基因组多态性优缺点 快速，成本低，灵敏度高； 直接鉴定混合样本，未知鉴定和目标鉴定均可； 通量高，每次几十样本以上； 无定量； 只有种群种类变化，无丰度变化； 比对分析； 分子鉴定---- rRNA操纵子分析 16s： 细菌种属的保守序列； 18S rRNA ：真菌类 Spacer region 5s：多态性、亚型 23s： 决定细菌抗性、亚型等； 分子鉴定---- rRNA操纵子分析 目前GeneBank等数据库中拥有全序列和rRNA序列的近万种 分子鉴定---- rRNA操纵子分析 RT-PCR鉴定原理 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ R Q Extension complete – probe is removed Fluorescent signal intensity is proportional to amount of amplicon produced. 引物设计 /BLAST/Blast.cgi 激发和检测 CFX96? FAST Real-Time PCR Top view