新型重组 AAV55 载体及包装系统.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, May 25; 26(5): 679−686 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2010 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 新型重组AAV5/5 载体及包装系统 1,2,3* 1* 1 1 1 董小岩 ，田文洪 ，袁振华 ，谭淑萍 ，吴小兵 1 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052 2 复旦大学 生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室，上海 200433 3 北京五加和分子医学研究所有限公司，北京 100176 摘 要: 本研究组建了一种可用于规模化生产的以重组单纯疱疹病毒为辅助病毒的AAV5/5 载体包装系统。首先，将5 型腺相关病毒 (AAV5) 的 rep 和 cap 基因插入 I 型单纯疱疹病毒 (HSV-1) 基因组非必需基因 UL2 中，获得重组病毒 rHSV1-rep5cap5 。其次，构建一种携带AAV5 ITR 的通用型载体质粒pAAV5neo ，将报告基因EGFP 插入pAAV5neo 中， 得到pAAV5neo-EGFP 质粒。将 pAAV5neo-EGFP 质粒导入 BHK-21 细胞，用G418 选择培养，挑选出表达EGFP 并在 重组病毒rHSV1-rep5cap5 感染下能高效产生rAAV5/5-EGFP 的单克隆载体细胞株C020 。用rHSV1-rep5cap5 感染C020 细胞制备rAAV5/5-EGFP ，用“氯仿处理-聚乙二醇/ 氯化钠-氯仿抽提”方法粗纯化rAAV5/5-EGFP 。用100 kDa 分子量 截流超滤方法进一步纯化和浓缩，获得高纯度的rAAV5-EGFP 。SDS电泳分析可见3 条特征性外壳蛋白带。电镜 分析显示病毒颗粒以实心颗粒为主。用rAAV5/5-EGFP 病毒按 1×105 vg/cell 感染体外培养的HEK293 细胞，可见30 ％ 细胞呈现绿色荧光。本研究提出了一种高效AAV5/5 载体生产系统和纯化方法，为重组AAV5 载体的进一步应用提供了 基础。 关键词: 5 型腺相关病毒 (AAV5) ，I 型单纯疱疹病毒 (HSV1) ，病毒载体，包装系统 A novel packaging system of recombinant AAV5/5 vector 1,2,3* 1* 1 1 1 Xiaoyan Dong , Wenhong Tian , Zhenhua Yuan , Shuping Tan , and Xiaobing Wu 1 State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, Institute for Viral Disease Prevention and Control , Chinese Center for Disease Prevention and Control , Beijin