分子病理学常用研究技术原理及应用培训.ppt

原位反转录PCR 将反转录反应和PCR结合，用于检测细胞内低拷贝mRNA 反应先以mRNA为模板进行逆转录反应合成cDNA 再以该cDNA为模板进行PCR 标本需经DNA酶预处理去除细胞内的DNA，以保证PCR所扩增的模板cDNA是mRNA的逆转录产物 原位再生序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction) 以mRNA为模板，通过逆转录酶、DNA聚合酶和RNA酶的作用，以RNA/cDNA和双链cDNA为中间体，直接扩增RNA靶序列 扩增反应在42℃下进行两小时，不需要热循环 该法为检测细胞内低拷贝数mRNA提供了一个新方法 因扩增反应在较低温度下进行，组织抗原保存较好，便于和IHC相结合 原位PCR的不足 ①特异性不高，特别是假阳性不可避免 ②技术操作复杂，影响因素多 ③需要特殊设备，原位PCR仪是必不可少的设备 引物介导的原位标记技术 primed in situ labeling，PRINS 基本原理是PCR和原位杂交的结合 先由寡聚核苷酸引物或变性DNA片段与固定在细胞内的靶DNA互补序列复性结合，在聚合酶驱动下，反应体系中带有标记的dNTP即以靶DNA为模板延伸，新合成的DNA上即带上标记物 ISH（含FISH） 原位PCR PRINS 基本原理 标记探针与待检核酸互补结合成杂交体，通过检测探针获得靶