在柯霍氏法则.PDF

分離（isolation ）、純化（purification ）、繁殖（propagation ）、保存（preservation ） 在柯霍氏法則：觀察病徵、由罹病組織分離病原、接種以及再次分離病 原菌的步驟中，分離是將特定的病原微生物，以可行的方法使之與植物組織 分離，但執行過程中並無法保證僅得目標微生物而無摻雜其他微生物，故應 再進行純化（purification ），如真菌常移植單一菌絲或單一孢子。分離或純 化過程主要目標是獲得單純的微生物，所使用的方法或培養基通常未能獲得 大量的微生物，故須再藉以適當養分的培養基給予適當的條件培養繁殖 （propagation ），得以獲得大量具有活力的微生物，以供接種、鑑定及研究 其生物學特性。當所獲得的菌株暫時不用或無法同時掌控大量的菌株，則須 尋求良好的保存方式，使之能長期保存，待有需要時可再移植獲得與保存前 相同活力的菌株。 （一）疑似病原之分離 在地球上絶大多數物體表面會有多種的微生物存在，罹病之植物也 不例外，故進行疑似病原之分離時，將罹病植物組織置放於分離培養基， 若無適當的表面消毒，通常植體表面的微生物（通常與病害無關的腐生菌） 會出現，干擾我們對疑似病原菌的判斷，故毒面消毒雖看來無關緊要，但 操作不當常成為重要的實驗干擾因素。若罹病組織為細薄的組織，如幼 根、細莖、薄葉等，常切小塊後經消毒水（如1%次氯酸鈉、0.1%昇汞水、 等量95%酒精+5%次氯酸鈉…等）表面消毒後，經無菌水將消毒水漂洗掉 再置於分離培養基，以去除雜菌而不損及組織內的病原菌為原則；較厚的 組織如粗根、果實及微管束組織，用水洗淨並以消毒液擦拭表面後，撕開 表皮，直接切取病組織(變色部位)進行分離。表面消毒的時間視所分離的 菌種、組織之粗細厚薄而定。有時可以用添加多種藥劑或抗生素之選擇性 培養基（selective medium ）（附錄-C 、D ），使大部分的微生物無法生長， 而某特定目標微生物得以長出。 1. 組織分離法(Tissue plating method) (1) 病害標本以水洗淨瀝乾。 (2) 以火燄滅菌之解剖刀切取病斑邊緣成2-4mm之小塊(含部分健康組織 及部分罹病組織約為2 ：1 ) 。 7-13 (3) 置入盛有0.5-1%次氯酸鈉（sodium hypochlorite ）消毒液之無菌培養 皿，可區分為未經表面消毒、表面消毒30 、60或120秒，再經無菌水 漂洗 3 次，漂洗時間可為數十秒至數分鐘，視分離目標物及操作經 驗而定。 (4) 以火燄滅菌過的鑷子夾取一塊病組織，以滅菌的濾紙吸乾後，置入 水瓊脂（附錄-A ）平板中，每皿置4-5塊組織。 (5) 靜置於桌面3 - 7天，觀察菌絲之生長情形。 (6) 觀察過程中，以火燄滅菌的移植針，挑取不雜有細菌的菌落邊緣的 菌絲塊，移入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar ，PDA ）平板 或試管中培養。或細菌菌落以劃線法純化培養（見後述）。 實習準備材料（每組）：罹病植物、無菌培養皿2個、5%次氯酸鈉少 量、無菌水適量、量筒大小各一、酒精燈、冷卻瓶、解剖刀、攝子、 移植針、滅菌之吸水紙、WA8皿、PDA6管。 00 120”120” 圖、罹病植物組織之真菌或細菌分離（Agrios 2005 ）。 7-14 2. 促進產孢法（induced sporulation ） 首先準備濕室（moist chamber ）--無菌培養皿（塑膠袋或其他乾 淨容器）內裝有潮濕（最好以無菌水濕潤）濾紙（或吸水紙），使容 器內可保持高濕度。罹病植物組織置於濕室內1-3天，促進病原產孢。 待病原菌產孢後，可直接以挑針挑起病原孢子培養。 3. 寄主篩選法 當罹病組織雜附有多種的微生物，並可能干擾疑似病原菌的分離， 可經由適當的寄主組織篩選