实验13-琼脂糖凝胶电泳的原理和方法(精品·公开课件).ppt

琼脂糖凝胶电泳的缺点： (1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 (3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 (4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 1.核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系 (1)DNA分子的大小： DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 (2)琼脂糖的浓度： 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示: (2)缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等 ，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8) 。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。 TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉 淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍。0.5×工作液也可提供足够的缓冲能力。 (3)凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，冷却至45-50℃时灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。 (4)样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料， 含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5% Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。 (5)电泳 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。 电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃，进行电泳。 (6)染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。 注意! 溴化乙锭（EB）为强致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 目前实验室一般用相对安全的GoldenView等核酸荧光染料代替。 生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作，1975年，Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法。随后，Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为Northern印迹，1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上 ，称Eastern印迹。 一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方向伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。 按电泳法分： 按超速离心法分： ?? 乳糜微粒（CM） 乳糜微粒CM ( 0.96 ) ???