大丽轮枝菌VdNEP与拟南芥互作的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 2015 年 5 月 7 日 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 □限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 20 年 月 日至 20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 摘要 摘要 摘要 大丽轮枝菌是诱发寄主植物黄化乃至枯萎的病原真菌，严重影响了许多农 作物的产量与品质。研究发现大丽轮枝菌分泌的糖蛋白 VdNEP 在侵染植物的过 程中具激发子和毒素的双重作用。然而目前大丽轮枝菌的毒素蛋白 VdNEP 在植 物细胞的定位及发挥作用的机制尚不清楚。研究大丽轮枝菌与植物相互作用的 分子机制，可为防治黄萎病提供行之有效的理论基础和新策略。本论文以大丽 轮枝菌的毒素蛋白 VdNEP 作为诱饵蛋白筛选拟南芥 cDNA 文库，以期能够筛选 到拟南芥体内与 VdNEP 有相互作用的蛋白。 首先将 VdNEP 构建到 BD 载体上得到表达 BD-VdNEP 融合蛋白的重组质粒 并验证了 VdNEP 对酵母 AHl09 菌株无毒性且不能激活报告基因的表达，说明酵 母双杂交系统可适用于诱饵蛋白 VdNEP。接下来用 VdNEP 作为诱饵同拟南芥 cDNA 的酵母文库进行杂交，利用营养缺陷型培养基和 X-α-gal 筛选阳性重组子。 提取阳性重组子中的文库质粒并测序，将测序得到的文库序列于拟南芥数据库 tair 中 Blast 比对，确定文库中插入基因的蛋白属性。最后选定 3 个筛选的文库 蛋白进行深入研究，分别为 R2 蛋白、M2 蛋白和 PDI 蛋白。 反向酵母双杂交实验将 VdNEP、R2、M2 和 PDI 基因序列构建成重组质粒 AD-VdNEP、BD-R2/M2/PDI，共转化 AD-VdNEP/BD-R2、AD-VdNEP/BD-M2、 AD-VdNEP/BD-PDI。实验结果表明 R2、M2 和 PDI 确实与 VdNEP 在酵母体内 存在相互作用。 去掉 R2、M2 和 PDI 的信号肽和跨膜序列，构建到表达载体 pGEX6p-2 上。 VdNEP 构建到表达载体 pET30 上。表达质粒转入大肠杆菌，IPTG 诱导表达并 进行 SDS电泳分析，M2 蛋白未检测到表达，R2 蛋白主要以包涵体形式 存在，PDI 蛋白易降解。所以 GST 融合蛋白体外 pull-down 实验验证蛋白间体外 互作的实验不能顺利开展。 BiFC 实验将 R2、M2 及 PDI 蛋白与 YFP C 端部分融合表达，将 VdNEP 与 YFP N 端部分融合表达。含不同重组质粒的农杆菌混合后注射到烟草的下表皮 细胞，培养 2-3 天后取样在荧光共聚焦显微镜检测荧光信号。研究发现 VdNEP 与 R2、M2 及 PDI 三者互作的强度顺序为：M2、R2、PDI。为了进一步研究互 作蛋白的互作机制，我已构建了 VdNEP、R2、M2 蛋白在植株体内过表达重组 I 质粒及诱导 R2、M2 基因沉默的重组质粒。后期将得到 VdNEP、R2、M2 蛋白 的过表达植株，以及 R2、M2 蛋白的敲除植株，进而可从植株的表型水平分析 VdNEP 与 R2、M2 的功能机制。 关键词：大丽轮枝菌；酵母双杂交；双分子荧光互补技术；蛋白互作 II Abst Abstract Abstract V.dahliae is a pathogenic fungi which can make host plants wilted, seriously affecting the yield and quality of many crops. It has been studied that during infection, V.dahliae secrete glycoprotein VdNEP with the dual function of elicitor and toxin. However, up to date,