大竹蛏肽聚糖识别蛋白的免疫防御功能研究-水产养殖专业论文.docx

万方数据 万方数据 上海海洋大学 杨顶珑硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 孙卫明 烟台大学 教授 主席 赵建民 中科院海岸带研究所 研究员 委员 杜荣斌 烟台大学 教授 委员 杨建敏 山东省海洋资源与环境研究院 研究员 委员 姜海滨 山东省海洋资源与环境研究院 研究员 委员 陈建强 山东省海洋资源与环境研究院 委员 答辩地点 山东省海洋资源与环境研究院 答辩日期上海 上海海洋大学硕士学位论文 大竹蛏肽聚糖识别蛋白的免疫防御功能研究 摘 要 大竹蛏（Solen grandis）属瓣鳃纲，广泛分布于中国沿海各地。因 其个体大、出肉率高、味道鲜美、营养丰富和经济价值高，大竹蛏已 成为我国重要的海洋经济品种之一。与其它海洋无脊椎动物相似，大 竹蛏缺乏获得性免疫系统，主要依靠先天性免疫系统抵御外界病原微 生物的侵害。 肽聚糖识别蛋白是无脊椎动物先天性免疫中重要的模式识别受 体，能够识别细菌的肽聚糖，在病原识别和清除过程中发挥重要作用。 到目前为止，对大竹蛏肽聚糖识别蛋白的研究非常有限，其抵御外来 病原入侵的作用机制尚不清楚。本研究结合分子生物学和免疫生物学 的实验方法和技术，对大竹蛏肽聚糖识别蛋白介导的免疫识别和免疫 应答进行研究，旨在深入了解大竹蛏的先天性免疫机制。 (一)序列分析 本研究获得了大竹蛏肽聚糖识别蛋白 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 编码基因的 cDNA，其全长分别为 1672 和 1285 bp，各自编码 270 和 141 个氨基酸。ExPASy 预测两个蛋白基因的理论等电点分别为 7.82 和 5.46，分子量分别为 28.4 和 14.7 kDa。 同源性分析显示 SgPGRP-S1 与 SgPGRP-S2 之间的相似度为 51%， 二者分别与光滑双脐螺（ABO40829）和囊舌虫（XP_002734591）的 I 肽聚糖识别蛋白同源性最高，相似度分别为 57%和 55%。 多序列比对发现，SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 序列中均存在高度 保守的 Zn2+结合位点和酰胺酶催化位点，Zn2+结合位点分别为 H135、 H244 和 C252 以及 H115 和 C123，酰胺酶催化位点分别为 H135，Y170， H244，T250 和 C252 以及 H115、T121 和 C123。 构建系统进化树探讨 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 与其它生物（牡 蛎、栉孔扇贝、海湾扇贝、果蝇和人）的进化关系，发现 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 与软体动物具有较高的同源性，与牡蛎的四种肽聚糖识 别蛋白-S1S、-S1L、-S2，-S3 聚合成支。 以上结果证明 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 是肽聚糖识别蛋白超家 族的重要成员。 (二)荧光定量 PCR 检测 SgPGRP 的转录规律 利用荧光定量 PCR 法检测了 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 在健康大 竹蛏组织中的 转录规律，发现二者在所有检测组织中都有表达。 SgPGRP-S1 在肌肉和肝胰腺中的表达量最高，其次为鳃、外套膜、性 腺，在血细胞中的表达量最低；SgPGRP-S2 在鳃和外套膜中表达量较 高，其次为血细胞和性腺，在肌肉中表达量最低。 此外，通过荧光定量 PCR 分析检测 LPS、PGN 和 glucan 刺激后 SgPGRP-S1 在血细胞中的表达规律。经 PGN 刺激后，SgPGRP-S1 的 表达量在 3 h 显著升高为对照的 14.3 倍；在 6 h 达到最高，为对照组 的 7471 倍；在 12 h 和 48 h 分别降低为对照组的 13.9 和 5.7 倍。经 glucan II 刺激后，SgPGRP-S1 的表达量在 12、24 和 48 h 分别显著升高为对照 组的 22.4、11.9 和 89.7 倍。而在 LPS 刺激后，SgPGRP-S1 的表达量 较对照组没有显著升高。 与 SgPGRP-S1 相比，SgPGRP-S2 的表达量在 LPS 刺激后升高显 著，在 6 h 升高为对照组的 4.1 倍，在 24 h 和 48 h 又显著下调为 0.1 和 0.3 倍。经 PGN 刺激后，SgPGRP-S2 的表达趋势与 SgPGRP-S1 相 似，在 6 h 达到高，在 12 h 略降低后，24 h 升高为对照的 4.4 倍。在 glucan 刺激组，SgPGRP-S2 的表达量在 12 h 显著升高为对照组的 23.1 倍，随后恢复到原始水平。 (三) rSgPGRP-S1 活性分析 PAMPs 结合实验表明，SgPGRP-S1 重组蛋白（rSgPGRP-S1）可 以体外结合 PGN，其结合能力随其浓度增大而