分子标记在植物线虫学应用技术.docVIP

分子标记技术在植物线虫学的应用 张卫东1 廖力1 蒋立琴2 徐淼锋1 陈其文1 （1. 珠海出入境检验检疫局 519015 2. 珠海市质量技术监督局 ） 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新型的遗传标记形式，它以核酸分子的突变为基础，是直接在DNA 分子上检测生物间的差异，是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异[1～3]。DNA分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，不受环境及基因表达与否的限制，具有多态性高，遗传稳定，检测手段简单、快速，检测结果客观准确等特点，可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题。因而，DNA分子标记技术自1974年Grodzicker创立RFLP技术以来，各种新型标记相继问世，并逐渐渗透到生命科学的各个领域。在植物检疫学科中，DNA分子标记技术已成功应用于植物病原真菌、细菌、昆虫和线虫等的研究中[4～8]。本文就分子标记在植物病原线虫学的应用作一综述。 1分子标记技术在植物线虫学的应用 1.1 限制性片段长度多态性（Restriction fragment polymorphisms, RFLP） 限制性片段长度多态性（RFLP , restriction fragment length polymorphism）是最早发展起来的分子标记技术之一[9]。其原理是对特定的DNA 片段的限制性内切酶产物进行分析，根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同，从而分析在同源序列上产生的DNA 片段长度多态性差异。此技术及其从中发展起来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA 的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA 片段、把DNA 片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA 片段（通过Southern 杂交）和分析结果。二十世纪八九十年代，该方法在植物线虫学中应用较多。如1986年Curran首先用该技术成功区分了Trichinella和根结线虫（Meloidogyne）；Burrows和Boffey用该技术区分了马铃薯金线虫（Globodera rostochiensis）及马铃薯白线虫（G. pallida）；Bolla等应用RFLP方法区分了松材线虫与拟松材线虫；Webster等构建了松材线虫的基因文库，从中筛选了来自rDNA的内切酶片段，并正确区分了不同来源的松材线虫与日本和欧洲的拟松材线虫[10～13]。 RFLP标记的具有重复性好、稳定性高和共显性遗传等特点。但是， RFLP 分析操作过程中涉及了DNA 的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和Southern 杂交等一系列分子生物学技术，步骤繁杂，工作量大，而且对DNA的需求量很大，检测多态性频率较低，特别是放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。因此很大程度上限制了该项技术的应用，已逐渐被其他新型标记所替代。 1.2 随机扩增多态性（Random amplified polymorphism DNA，RAPD） RAPD技术是由Williams等(1990)发明的一种新的分子标记技术，基本原理是利用一系列不同的碱基随机排列的寡聚核苷酸单链作为引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，EB显色或放射性自显影来检测扩增DNA片段的多态性，这些扩增的DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性[14]。RAPD 反应引物是随机排列的，无须专门设计，引物较短，可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，构建基因组的指纹图谱，通过统计分析为物种进化和分类提供DNA水平上的理论依据，对于种、亚种、变种的鉴别与演化关系的研究具有重要意义。 Irdani等（1995）、Braasch和 Burgermeister（1995）、郑经武等（1998）、汪来发等（2001）用RAPD技术成功的区分了松材线虫与拟松材线虫[15～18]。此外张路平等（2002）对松材线虫与拟松材线虫的线粒体DNA进行了RAPD分析，将松材线虫的群体分成日本株系与北美洲株系[19]。Amiri等（2003）应用RAPD技术构建了区分甜菜胞囊线虫（H. schachtii）和H. betae的图谱[20]；Carneiro 等（2004）利用RAPD技术对来自巴西、美国咖啡上的根结线虫进行遗传学变异分析[21]；Lax 等（2004）首次对来自阿根廷的大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）进行了RAPD分析，指出两群体间存在明显的遗传学差异，并分析可能是由于基因漂移或不同管理措施所造成的结果[22]。此外，RAPD标记成功应用于鳞球茎线虫（Ditylenchus dipsaci）、马