肿瘤的分子生物学检验技术培训.ppt

线粒体的主要功能 1、参与人体很多重要的生物化学过程（三羧酸循环、脂肪酸β氧化、氨基酸分解代谢、血红素合成和部分尿素合成过程）被称为“细胞的能量工厂” 2、线粒体体积大小，数量增减反应器官功能负荷的变化。 （二）线粒体基因表达系统及特点 1、密码子 （二）线粒体基因表达系统及特点 2、mtDNA复制特点 D环复制为主要模式，重链以逆时针方向复制，轻链以顺时针方向复制。 nDNA只在细胞分裂时复制，mtDNA一直处于分裂状态，并由nDNA编码的调控因子控制。 mtDNA复制特点 mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（OH）与L链复制起始点（OL）相隔2/3个mtDNA。复制起始于L链的转录启动子，首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，复制一条互补的H链，取代亲代H链与L链互补。被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。 （二）线粒体基因表达系统及特点 3、mtDNA转录的特点 对称性转录，重链启动子启动重链顺时针方向转录，轻链启动子启动轻链逆时针方向转录。 成熟的mRNA只在3ˊ末端加polyA尾巴，5 ˊ末端不修饰帽子结构 （二）线粒体基因表达系统及特点 4、线粒体蛋白质的合成特点 自主编码合成13个多肽，其余功能所需蛋白均由核基因组编码，与细菌合成蛋白质体系十分相似。“共生学说” 二、线粒体病的概念 因线粒体功能受损或缺陷而导致的疾病。 主要累及大脑和肌肉组织。 分为线粒体肌病，线粒体脑病、线粒体脑肌病 三、线粒体病的特征 （一）母系遗传 与遗传早发 线粒体疾病的母系遗传 四、线粒体病的分子生物学检验标志 四、线粒体病的分子生物学检验标志 （一）mtDNA碱基位点 1、点突变 1）结构基因点突变包括同义突变和错义突变，错义突变导致氨基酸的替换，由此引起蛋白质结构和功能的改变，导致疾病。 Leber视神经病（LHON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因） 1、点突变 2）tRNA基因的点突变，可以降低线粒体内蛋白质的生物合成的能力，从而影响线粒体氧化磷酸化的功能，导致疾病的发生。 MELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）： A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因） 四、线粒体病的分子生物学检验标志 2、单核苷酸多态性位点 单个核苷酸变异引起的mtDNA序列的多态性，与不同人群有关。 3、线粒体单体群 在进化过程中，母系遗传的mtDNA为适应环境所形成的碱基位点多态性集合。 （二） mtDNA缺失或插入片段 大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。 大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。 常见缺失： 8483～13459：Kearns-Sayre综合症（KSS）、缺血性心脏病 ； 8637～16073：与衰老有关的退行性疾病； 4389～14812：能量代谢受到严重破坏 。 （二） mtDNA拷贝数的变化 mtDNA拷贝数可作为评价线粒体功能的指标，当拷贝数减少时导致细胞能量缺乏，由此引发疾病，在胃癌、食管鳞癌等肿瘤细胞中mtDNA拷贝数下降，有可能成为一种新的肿瘤标志物。 一、线粒体病分子生物学检验策略 二、线粒体病的分子生物学检验技术 （一）PCR-RFLP技术 PCR-RELP的质量控制 （1）模板DNAD的制备和引物设计：设计合适的引物扩增目的模板DNA （2）酶的选择：去除干扰物质，根据酶活性要求选择适宜的缓冲液、活性剂等，酶的用量不超过总体积的10%。 （3）PCR扩增体系和酶切反应条件：优化保证PCR产物的纯度和精度，设计好酶切反应体系，根据内切酶活性，适时终止反应。 （4）结果分析：根据酶解片段选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，染色后观察扩增基因的变异情况。 二、线粒体病的分子生物学检验技术 （二）变性高效液相色谱法 DHPLC检测的质量控制 1、 DHPLC检测的样本要求 （1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。 （2）样品质量：检测前不许纯化，核苷酸和引物会很早被洗脱，模板大分子在样品峰后洗脱。引物二聚体和非特异性扩增及碱基数类似的污染物需优化PCR去除。 （3）样品含量：PCR浓度必须足够大，要求2微升产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带，相当于浓度至少20ng/ul. 2、DHPLC检测的条件优化 （1）PCR引物的设计：引物长度200-500b