《双向电泳》-精选·课件设计.pptVIP

State Key Laboratory of Food Science and Technology State Key Laboratory of Food Science and Technology 双向电泳技术two-dimensional electrophoresis 目 录 PART 1 技术原理 PART 2 操作流程 PART 3 实验方法 PART 4 蛋白质组学 双向电泳技术原理： 第一向进行等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)，蛋白质沿 pH 梯度分离至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行 SDS—PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。电泳的结果不是蛋白质条带，而是点。 PART 1 技术原理 PART 1 技术原理 等电聚焦电泳 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。 PART 1 技术原理 等电聚焦电泳原理 等电聚焦（IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置pH值，便可以得到它的等电点。 PART 1 技术原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 作用原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）。 非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 双向电泳技术操作流程： PART 2 操作流程 第一向电泳——毛细管等电聚焦电泳（IEF） 1.仪器准备 双向电泳系统一套（见清单） 烧杯1000 mL 、50 mL 各1个 量筒1000 mL （或500 mL）、100 mL 、10 mL各 1个 注射器1 mL（带长针头）、微量注射器100μL（或50μL）各1支 大塑料盒1个 滴管1支 PART 3 实验方法 2．溶液配制 (1)覆盖溶液（25 mL/班） 含8 mol/L尿素，1%两性电解质pH3~9.5，5% (w/v) NP40(Nonidet P 40 Substitute)和100 mmol/L DTT 取12 g尿素，0.25 mL两性电解质(pH 3~9.5)，12.5 mL的10%的NP40和0.386 g DTT，用重蒸水溶解后，定容到25mL。溶液不能受热,储存在冰箱中。 (2)平衡溶液（250 mL/班） Tris-HCl( pH 6.8)缓冲液，含2%SDS，100 mmol/L DTT和10%甘油 取15 mL Tris-HCl(pH 6.8)，50 mL 10%SDS，3.86 g DTT和29 mL甘油，用重蒸水定容到250 mL，室温存放。 PART 3 实验方法 (3) 30% Acrylamide第一向储液（100mL/班） 含28.4% (w/v) acrylamide和1.6% (w/v) N,N-methylene-bis-acrylamide 用重蒸水先将1.6 g bisacrylamide溶解后，再加入28.4 g acrylamide，溶解，用重蒸水定容到100 mL