甘油激酶与核受体Nur77相互作用及其对肝脏脂代谢调控研究-制药工程专业论文.docx

摘 要 本课题前期研究发现，GK 与核孤儿受体 Nur77 存在蛋白质相互作用。近年 研究表明，Nur77 和 GK 与肝脏脂代谢过程存在密切联系，提示 GK 与 Nur77 可 能通过蛋白质相互作用对肝脏脂代谢进行调控。本文对 GK 和 Nur77 相互作用进 行深入研究，揭示其对肝脏脂代谢调控功能的影响，为脂代谢调控和代谢类疾 病的发病机制和治疗提供线索；同时为后续动物实验建立基础，构建了 GK-pCDH 过表达慢病毒和 GK-pSicoR 干涉慢病毒载体，获得稳定过表达/干涉 GK 的慢病毒。 本文首先利用免疫共沉淀技术，对 GK 与 Nur77 相互作用及作用域进行确 认。进而利用 Nur77 对荧光素酶报告基因 ApoA5 promoter 的转录激活作用，检 测 GK 对 Nur77 的转录激活活性的影响。同时，选取几个受 Nur77 调控的脂代谢 相关基因，在人肝细胞系 L02 及小鼠体内同时转染 GK 和 Nur77 的表达载体，进 行实时定量 PCR 实验，检测各基因在肝中 mRNA 水平表达状况。此外，将 GK 的 CDS 序列构建到 pCDH 慢病毒质粒中，并将有效干涉 GK 的 siRNA 序列构建 到 pSicoR 慢病毒质粒中，293T 细胞包装获得慢病毒，检测慢病毒滴度，并对 GK 慢病毒过表达/干涉效果进行检测。 由免疫共沉淀实验证实 GK 与 Nur77 存在相互作用，GK 的 N 端和 C 端是相 互作用的结构域。GK 使 Nur77 报告基因转录活性降低，激活倍数可 3 倍降低至 0.5 倍，抑制效果明显，且不依赖于 GK 的激酶活性。Real-time PCR 结果显示 Nur77 对 Srebp-1c、Fas、Gpam 和 Acaca 基因表达有抑制作用，经 GK 加入后可 将表达由 20%回转至 90%。同时成功构建了 GK 过表达慢病毒载体 GK-pCDH 和 GK 干涉慢病毒载体 GK-pSicoR，滴度分别达到 7.8×106pfu/ml 和 2×107pfu/ml， GK 蛋白过表达/干涉效果明显。 上述研究揭示了 GK 与 Nur77 的相互作用及其对肝脏脂代谢调控功能的影 响，构建了 GK 慢病毒为后续实验建立基础。 关键词： 甘油激酶 核孤儿受体 Nur77 脂代谢 蛋白质相互作用 ABSTRACT Interaction between GK and Nur77 had been found in our previous research. Recent studies show that GK and Nur77 play important role in liver lipid metabolism, so GK may regulate lipid metabolism through protein-protein interaction with Nur77. In this study, we research protein-protein interaction between GK and Nur77, reveal the function in liver lipid metabolism, provide ideas for pathogenesis and therapy of diseases about lipid metabolism. And to establish a basis for animal experiments, we construct a lentiviral vector for GK expression and another for GK RNA interference, and gain the lentiviral particles which can stably up/down-regulate the expression of GK. Firstly we use co-IP to confirm the interaction between GK and Nur77, and interaction region of GK. And then we use the luciferase reporter assay to examine the influence of Nur77 transcriptional activity by GK. And then we choose genes which could be regulate by Nur77 in lipid metabolism, co-transfect GK and Nur77 expression ve