弓形虫排泄分泌抗原(ESA)通过内质网应激信号通路诱导神经干细胞凋亡微生物学专业论文.docx

5 5 FCM检测NSCs凋亡的结果 25 DNA Ladder 检测 NSCs 凋亡的结果 27 3.4 抑制剂预处理对NSCs凋亡水平及ERS凋亡通路活化的影响 27 3.4.1 抑制剂预处理对NSCs凋亡水平的影响 27 3.4.2 抑制剂预处理对ERS凋亡通路活化的影响 28 4 讨论29 5 结论32 参考文献33 附一（个人简历） 40 附二（致谢）41 附三（综述）42 安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 - - PAGE 1 - 英文缩略词汇表(Abbreviation) 英文缩写 BSA 英文全名 Bovine Serum Albumin 中文全名 小牛血清白蛋白 Caspase12 CHOP DMEM DNA Ladder ER ERS ESA FBS FCM FITC JNK MW PBS PI RPM TUDCA Cysteinyl aspartatel-specific proteinase C/EBP homologous protein Dulbcco’s Modifed Eagle Medium Deoxyribose nucleic acid ladder Endoplasmic reticulum Endoplasmic reticulum stress Excretory/secretory antigens Fetal Bovine Serum Flow cytometry Fluoresceinisothiocynate c-jun N-terminal kinase Molecular Weight Phosphate Buffer Propidium iodide Revolutions per minute Tauroursodeoxycholic acid 半胱天冬氨酸酶 12 C/EBP 同源蛋白 DMEM 培养液 脱氧核糖核酸梯度 内质网 内质网应激 排泄分泌抗原 胎牛血清 流式细胞术 异硫氰酸荧光素 c-jun 氨基端激酶 分子量 磷酸盐缓冲液 碘化丙啶 每分钟转速 牛磺熊去氧胆酸 Z-ATAD-FMK Z-Ala-Thr-Ala-Asp(OMe)-FMK 苄氧羧-丙酰胺-苏氨酸-丙氨 酰-天冬酰胺-氟甲基酮 弓形虫排泄分泌抗原（ESA)通过内质网应激信号通路诱 导神经干细胞凋亡 硕士研究生： 王 腾 导 师： 余 莉 安徽医科大学微生物学教研室 中 文 摘 要 目的 探讨刚地弓形虫对体外培养的神经干细胞（NSCs)凋亡水平的影响及其分 子机制。 方法 (1)NSCs 的分离、传代及鉴定。将 6-8 周龄的 ICR 小鼠按照雌：雄=2:1 的 比例合笼，在孕 13-15d,剖宫取小鼠胎盘，分离两侧大脑半球，制备单细胞悬液， 传代培养，传代过程中使用 Nestin 抗体对其进行免疫荧光染色鉴定。（2）小鼠全 基因组表达谱芯片筛查弓形虫感染组 NSCs 差异表达基因。建立弓形虫与 NSCs transwell 共培养体系，上室加入 1×106 个 RH 速殖子，下室为 NSCs，感染 48h 后，收集感染组和对照组的下室 NSCs，分别提取细胞的总 RNA，进行全基因组表 达谱分析，筛查差异表达基因并进行 GO 分析。（3）NSCs 凋亡的检测。采用 transwell 共培养体系，上室中加入 2×105、1×106、5×106 个速殖子，与下室中 NSCs 共培养 12h、24h 和 48h 后，收集下室 NSCs 细胞，运用 Annexin V-FITC/PI 双染法和 DNA Ladder 法检测 NSCs 的凋亡情况。（4）内质网应激信号通路抑制剂预处理后 NSCs 的凋亡情况及相关蛋白分子的表达水平。分别用 0.5mmol/L TUDCA 和 4μmol/L Z-ATAD-FMK 预处理 NSCs 6h，然后建立共培养体系，感染 48h 后收集细胞，Annexin V-FITC/PI 法检测细胞凋亡，免疫印迹检测 CHOP、caspase12、JNK、p-JNK 的蛋白 表达水平。 结果 （1）成功制备小鼠胚胎NSCs并在体外传代培养，NSCs特异性标记蛋白nestin 表达阳性。（2）基因表达谱芯片筛查结果发现，与正常对照组相比，弓形虫共培 养48h的NSCs有973个基因表达上调（≥2倍）、871个基因表达下调（≤2倍）。GO分 析显示细胞凋亡生物学过程受到显著影响，有15个参与此过程的基因表达明显升 高（≥2倍）。（3）NSCs与弓形虫共培养12h、24h、48h后，其凋亡率分别为26.21 ±0.78%、37.01±1.23%和45.70±0.56%，而对照组的凋亡率分别为21.12±1.34%、 25.13±2.07%和25.31±1.03%，弓形