当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2致人脐静脉内皮细胞损伤的影响-中西医结合临床专业论文.docx

致谢58 在学期间的研究成果59 II 当归红 当归红芪合剂超滤膜提取物对 H2O2 致人脐静脉内皮细胞损伤的影响 PAGE PAGE 10 摘 要 目的: 观察当归红芪合剂超滤膜提取物对过氧化氢(H2O2)损伤人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的保护作用和内皮细胞凋亡相关基因在此过程中的作用,探讨其在心脑血管疾 病治疗中的机制。 方法: 用 200μmol·L-1 H2O2 制造 HUVEC 损伤模型；按分组把不同浓度、不同分子 量（5 万分子量，10 万分子量，20 万分子量）的当归红芪合剂超滤膜提取物于损伤后加 入,分别测定细胞活力(MTT 法)，观察当归红芪合剂超滤膜提取物对 H2O2 损伤内皮细胞 活性的影响；实验分正常对照组、单纯药物组、H2O2 损伤组、药物干预组，采用黄嘌呤 氧化酶法检测细胞中 SOD 活力；采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛（MDA）活 力；流式细胞仪技术检测细胞周期及细胞凋亡；化学法检测细胞内 Ca2+浓度及细胞培养 上清液中 NO 的浓度；应用 RT-PCR 和微阵列相结合的实验新技术―PCR Array‖ 检 测 与 内皮细胞损伤相关的分子在各组间的差异表达；RT-PCR 技术从 mRNA 水平检测各组与 凋亡相关的基因的表达；Western Blot 技术从蛋白水平检测各组凋亡相关基因的表达。 结果: 1. MTT 结果显示：100、200、300μmol·L-1 的 H2O2 分别作用 ECV-304 细胞 6h、12h、 24h、48h 后细胞活性明显下降，与正常对照组比较有显著性差异(P﹤0.05)。200μmol·L-1 的 H2O2 孵育 6h，细胞活性值为正常对照组细胞活性值的一半（LD50）,细胞损伤适中。 2.不同浓度当归红芪合剂超滤膜提取物用药组与对照组之间 MTT 值有显著性差异 （P 0.05）；当归红芪合剂超滤膜提取物作用 ECV-304 细胞 32h，在 1.5g/L～21.0g/L 浓度范围内有显著的促增殖作用。尤其以 6.0g/L～15.0g/L 浓度范围增殖作用达高峰。 3.H2O2+当归红芪合剂超滤膜提取物 5 万、10 万、20 万分子量 6.0g/L,与对照组比 较有显著性差异（P﹤0.05）；与 H2O2 损伤组相比有显著性差异（P﹤0.05），且以 10 万分子量 6.0g/L 的增殖作用最强； 4.200μmol·L-1 H2O2 作用 ECV304 细胞 6h 后可以明显降低 SOD 的活力，提高 MDA 的含量，与正常对照组相比具有显著性差异（P﹤0.05）；药物干预组与 H2O2 组相比有 显著性差异（P﹤0.05）。与正常对照组比较，H2O2 损伤组细胞内 Ca2+浓度明显上升（P ﹤0.05）；与 H2O2 损伤组比较，药物干预组细胞内 Ca2+浓度明显下降（P﹤0.05）。 5.与正常对照组比较，H2O2损伤组细胞凋亡率明显增加（P﹤0.05），细胞HSP70 基因表达上调（P﹤0.05），eNOSmRNA表达下调（P﹤0.05），细胞培养上清液中NO含 量降低（P﹤0.05）。与H2O2损伤组比较，药物干预组细胞凋亡率明显降低（P﹤0.05）， 细胞HSP70基因表达上调（P﹤0.05），eNOSmRNA表达上调（P﹤0.05），细胞培养上 清液中NO含量升高（P﹤0.05）。 结论： .过氧化氢可以引起内皮细胞存活率下降，其中以 200μmol·L-1 作用 6h 细胞损伤适 中。 .当归红芪合剂超滤膜提取物作用 ECV304 细胞 32h，在 1.5g/L～21.0g/L 浓度范 围内有显著的促增殖作用。尤其以 6.0g/L～15.0g/L 浓度范围增殖作用达高峰。 3.当归红芪合剂超滤膜提取物对 H2O2 损伤后的内皮细胞有保护作用, 其中以 10 万 分子量，6.0g/L 保护效果最为明显。且其保护作用可能是通过调节细胞周期参与了对 ECV304 增殖的影响。 4.当归红芪合剂超滤膜提取物对 H2O2 致内皮损伤的细胞具有保护作用，其作用是 通过提高 SOD 的活力，降低 MDA 的活力，减少细胞内 Ca2+的释放，以及减少内皮细 胞凋亡等机制来实现的。 5.当归红芪合剂超滤膜提取物对 H2O2 引起的内皮细胞损伤有拮抗作用，具有抗 H2O2 致人脐静脉内皮细胞凋亡的作用，具有促进 HSP70 基因的表达，维持正常内皮细 胞功能，上调 eNOSmRNA 表达，维持 NO 合成与分泌的作用。 关键词：超滤膜；当归；过氧化氢；红芪；人脐静脉内皮细胞 ABSTRACT Objective:To observe the protective effect of the ultra-filtration extract