副猪嗜血杆菌神经氨酸酶的理化特性及其免疫原性研究-预防兽医学专业论文.docx

咱叫‘_- iN111111mwwwmw Y1801注J I 论文独创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签叫多是 j )，0 /0 年 6 月 h 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留并向国家有 关部门戚机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印成扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。问意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部戒部分内容。 研究生签名:制拉j .t: Cλd ...(e 年 4 月 μ日 ，.，(0 年 d 月沁日 符号说明 Hps 剧猪嗜血杆菌 h 小时 mm 分钟 s 秒 M 摩尔/升 L 升 ml 罢法升 111 微升 Kg 千克 g 克 mg 瑾克 I1g 微克 ELISA 酶联免疫吸附试验 旧A 间接血凝试验 OD 光密度吸收值 NA 神经氨酸酶 TMB 3，3，5，5-四甲基联苯胶 CPU 菌落形成单位 kD 千道尔顿 mollL 摩尔/升 P日S 磷酸盐缓冲液 r/min 每分钟转数 NAD 烟酌服腺嘿岭二核背酸 HRP-IgG 酶标二抗 / / 摘要 副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis ，Hps) 引起猪的 一种全身性疾病，以纤维索性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。该病目前 对猪场的危害较大。神经氨酸酶是副猪嗜血杆菌一种潜在的重要毒力因子，本试 验对 Hps 神经氨酸酶的理化特性和免疫原性进行了研究，研究内容如下: 寸、 Hps 神经氨酸酶的理化特性研究 Hps 神经氨酸酶的提取与纯化:分别对血清 5 型(Hpsδ)和血清 12 型(Hps-12) 菌株进行培养，收集菌体，经超声波破碎法提取神经氨酸酶粗酶，再对粗酶用硫 酸锻盐析和 Q Sepharose FF 阴离子交换层析纯化，再经 SDS电泳和神经 氨酸酶检测试剂盒进行鉴定。神经氨酸酶提纯物经 SDSPAGE 电泳结果表明， Hps-5 和 Hps-12 提取物均只有一条蛋白电泳带，其分子量约为 100ω，提纯的 Hps 神经氨酸酶通过酶活性检测， Hps-5 和 Hps-12 酣活性分别为 375.9 unit/mg 、 377.9 unit/mg 0 结果表明，从 Hps5 和 Hps-12 菌株中提取到纯度高、活性好的 Hps 神经氨酸酶。 +Hps 神经氨酸酶的理化特性:用检测试剂愈对不同 pH 值、温度和金属离子 条件下的神经氨酸酶活性进行检测。结果表明: Hps-5 和 Hps-12 血清型的神经 氨酸酶理化特性相似， pH 值为 8.0 和温度为 30.C ，是酶的最佳条件，以0.05mol/L + 的 的 Fe +... Cu2 和 SDS 对酶的抑制作用最强，神经氨酸酶活性基本消失， 0.05mol/L 浓度的 Ca2+、Mi+和 EDTA 对酶的活性影响也较大，表现出较强的酶活抑制性。 2、副猪嗜血杆菌神经氨酸酶对小鼠免疫原性的研究 两种纯化的 Hps-5 和 Hps-12 神经氨酸酶分别进行 Westem Blotting ，结果显 示两种神经氨酸酶均能与 Hps 的阳性血清出现较强的反应。分别用灭活的 Hps-5 ， Hps-12 全菌及其神经氨酸酶(N A-5，NA-12) 与弗氏佐剂按 1: 1 体积充分乳化，对 小鼠进行免疫，共 2次。分别在首免后 Od、14 d、28 d、42d 采血，用间接 ELISA 方法测定血清的抗体，结果首免后 14d 可检测到抗体， 28d 的 OD450 吸光值可达 // / 1.22.0 之间， 42d 的 OD450 吸光值仍可远1.4-1.90 通过 MTT 法检测神经氨酸酶 对小鼠脾淋巴细胞增殖能力，其 Hps-5 和 Hps-12 的神经氨酸酶的转化事均为 15%22% 。在最后一次免疫两周后，分别用向型商株和异型菌株对其攻毒， NA12 免疫组对 Hpsδ 菌株和 Hps-12 菌株的保护率均为 66.7%，NA-5 免疫组对 Hps-5 11 11 菌株的保护率为 50%，对Hps12 菌株的保护率为 66.7%。结果表明神经氨酸酶 是 Hps 的主要免疫保护性抗原之一，为进一步研究 Hps 亚单位疫苗提供理论依据。 关键词 z