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DNA寡核酸杂交 荧光寿命 DNA寡核酸杂交 DNA单链分子杂交成一个双链分子是一个基本的生化反应。杂两个互补配对的 交反应的程度会因为一条链的修饰，或者是加入了外源化学物质或者是蛋白，而使整个反应受到抑制或者是被调整(例如，单核苷酸多态性)。 在这篇技术通讯中，我们利用建成好的杂交反应作为模式系统，用以证实如何使用荧光寿命作为一个信号指标，来监测一个生化反应。我们已经制定了与荧光寿命实验相关的理论和技术方面的基本条件。简而言之，对荧光标记发出的荧光，我们用几个参数加以定义，其中包括荧光寿命。这个参数易于受标记物周围环境的变化发生改变。 在化学反应中，环境发生改变，决定的荧光寿命相应也会改变。因此，可以用荧光寿命用以监测这样的反应。首要的是选择一个合适的标记，并且它能够定位在其中一个反应物上，而且具备读取这个参数(荧光寿命)的技术手段。使用 Tecan Ultra Evolution微孔板，选择荧光寿命检测模式，使得能够自动化检测荧光寿命。我们选择了一对互补的15个碱基的寡核苷酸，其中一条链在3端标记了红光吸收的荧光标记物，TAU670。以下详细的讨论了对测量的数据的还原过程，从而为下面两点予以支持(i)如何从一个测量点获得尽可能多的信息;(ii)如何评价信息的质量。 1 数据分析 使用 Tecan Ultra Evolution平台进行的荧光寿命检测，可以获得大量的参数。但是，哪个信息是关于样品的呢,以下的图表正阐明了这一点。从每一个样品中获得的原始数据是荧光的衰减曲线，图一显示的是一个例子。 我们可以把衰减曲线理解成在样品中存在多少激发态的分子。在一个短暂的闪烁光激发了大量的荧光标记物后，荧光标记物将释放能量，回到能量基态。每个单个分子所耗费的这段时间是不可预测的。平均下来，在激发态的分子维持在激发态的时间，就作为该荧光标记分子的荧光寿命。一条完整的衰减曲线，代表一个统计学过程的瞬时阶段。 衰减曲线包含了有关这个样 品的信息。 为了得到相关的数据信息，需要用 ULTRA Evolution控制软件建立一个数学模型。首先，会产生上述的许多参数。在文献1中，讨论了这些参数的含义以及它们的相关性。我们将把不同的理论模型放在寡核苷酸测试系统中。图2中显示的杂交反应的滴定曲线。当加入递增数量的互补的单链寡核苷酸(命名为Oligo2)以及一套标记的寡核苷酸(Oligo1)，更多的双链DNA将会产生。总之，每个样品包含三类，单链标记Oligo1，单链Oligo2，以及标记的双链DNA。明显的是，两类标记会产生荧光信号，因此，任何荧光寿命衰减曲线的形状，必定是个混合群。 ? 单阶曲线 尽管事实上衰减曲线中不只包含一个荧光寿命的组件，但是值得尝试用最简单的数学模型，即单阶模型加以解析。这里曲线的形状对应的一个参数，就是单阶荧光寿命。在复对数曲线中，如图 1所示，单阶时间寿命是衰减曲线线性回归后得到斜率。即使曲线本身是弯曲的，但一个简单的描述就能反映出这条衰减曲线的一些信息。实际上，简单的描述往往最能反映样品的化学状态。因此，只检测单一的荧光寿命，将是极具重复性的，其所引起的相对错误率不到1%。 将这种前沿方法与其它的几类方法，如荧光强度检测，荧光偏振，进行了比较，凸显出这种方法的优越性:在那些检测模式中，不能区分不同的信号源。尤其对于样品中包含了两类物质。并且其它方法一般只能得到一个平均的数值。而这类方法产生的图形，能够用以监测复杂样品的化学状态。在荧光寿命检测中，荧光衰减曲线上偏离线性回归方程的数据点将能够产生与反应中混合物状态关联的信息。 图 3显示的是利用单阶荧光寿命曲线做信号指标，所得到的结合曲线。荧光寿命的变化范围从3纳秒到1.8纳秒。由此，得出的动态范围为1.2纳秒，并且荧光寿命读数中相对错误率非常低，大约在0.4%。用Z值评测这个检测结果，得 出的z值非常高，大概在0.95。此外，该实验测试灵敏度很高，可以检测到6nm的标记浓度，每孔的平均检测时间为1秒。关于浓度以及测量时间之间的相互关系下面还将继续讨论。 ? 双阶函数 一个双阶函数模型的建立，是试图解决在一个混合物中每一个亚类中的各个组件。我们用四个参数，两个时间寿命τ 1 和 τ 2，以及两个对应的振幅参数描述这个事件中的曲线。使用这四个参数的任何一个做信号指标，来反映样品的化学状态的尝试遭到了失败。更明显的是反映在Z 值的计算，其位于-1和0.3。负的 Z 值代表着不能区分自由和结合状态，而只有 Z 值在0.6以上时，才是一个可行的检测。 因此，有必要将四个参数都要加以考虑，才能获得比较完整的信息。为了用单一的数值来表现出复杂的化学反应，可能需要 (i)平均时间寿命τ 结合四个参数， 包括振幅比值，而且需要(ii)了解混合物的中每个组分的荧光