蔗糖酶蛋白量的测定Folin酚法.pptVIP

实验三 蔗糖酶蛋白含量的测定 ——Folin-酚法 * * 一、实验目的和要求 1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； 3、掌握分光光度计的使用方法。 二、实验基本原理 Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L.优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点： 该反应受多种因素的干扰。 1. 蛋白质(肽键) OHˉ 甲试剂 (酒石酸钾钠铜盐) 生成紫红色络合物 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸 紫红色络合物 OHˉ 乙试剂 产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物） 二、实验材料与试剂 1、实验材料： 蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。 2、实验试剂： ⑴ 标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 ⑵ Folin-酚试剂 ① 甲试剂 ② 乙试剂 三、实验器材与仪器 1、试管及试管架； 2、可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿； 3、恒温水浴箱(25℃）。 四、实验操作方法和步骤 1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线 取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（ A500nm值）。 混匀，在室温下静置20min 混匀，在室温(25℃）下静置10 min 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin-酚试剂乙 （ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水 （ml） 5 5 5 5 5 5 Folin-酚试剂甲 （ml） A500nm 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5g/L标准蛋白质溶液（ml） 6 5 4 3 2 1 试管号 表1 2、各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定 由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。 取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（ A500nm值）。