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不经培养的农田土壤微生物种群构成及系统分类的初步研究_cropped 42 卷 4 期 Vol . 42 No . 4 微生物学报 2002 年 8 月 Acta Microbiologica Si nica August 2002 不经培养的农田土壤微生物种群构成 及系统分类的初步研究 陈 灏 唐小树 林 洁 张伯生 任大明 ( )复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室 上海 200433 摘 要 :采用一系列的现代分子生物学技术 ,避开传统的分离培养过程 ,探讨自然界中微生物 种群的基因多样性 。经过直接从土壤中抽提总 DNA ,并对总 DNA 中 16S rDNA V3 可变区序列 作 PCR 扩增 、变性梯度凝胶电泳等 ,对农田土壤微生物种类分布进行初步的研究 ,发现不同 的农田土壤间的菌种差异相当显著 ,同时对部分农田微生物的系统分类作了初步尝试 ,为农 田土壤微生态和高效菌肥的研究提供了新的实验依据 。 关键词 :不经培养 , 微生态 , 系统进化 () 中图分类号 :Q938 文献标识码 :A 文章编号 :000126209 20020420478206 越来越多的证据显示可在实验室培养的菌种仅占自然界中细菌种类的极小部分 ,还 有相当多的菌种因为无法培养而未被人类所认识 ,而它们所包含的极大量的遗传基因是 1 一笔无法估量的财富 。不经过传统培养 ,直接从土壤中抽取总 DNA,并进行分子生物学 分析来研究土壤微生物种群情况 ,是近几年逐步发展起来的全新实验手段 。通过这种实 验技术 ,可以有 效 地 避 免 在 传 统 富 集 , 培 养 , 分 离 , 研 究 过 程 中 造 成 的 微 生 物 多 样 性 丢 2失 ,种群构成发生变化等弊病 ,能够更直接更可靠的反映土壤微生物的原始组成情况 。 实验中采集了几种种植不同农作物的农田土壤 ,分别抽取其中的微生物总 DNA 后 ,通过 PCR 及变性梯度凝胶电泳获得了各种农田土壤中微生物 16s rDNA V3 序列的分布 , 对其中部分序列进行测序和生物信息学研究以后 ,对农田微生物分布做了初步研究 。1 材料和方法 111 材料 11111 土壤样品 :土样 1 :农田旁未耕种土壤 ; 土样 2 : 小麦育种田土壤 ; 土样 3 : 蔬菜育种 田土壤 ; 土样 4 : 玉米育种田土壤 ,这四份土样均采自上海农业科学院 ,采样距离不超过 50m 。土样 5 :棉花农田土壤 ,土样 6 : 毛豆农田土壤 ,这两份土壤采自安徽省当涂县江心乡 ,采样距离不超过 100m 。土样 7 :青菜农田土壤 ,土样 8 : 茄子农田土壤 ,这两份土样采 自安徽省当涂县城关镇五一村 ,采样距离不超过 50m 。 5 ( 11112 其他材料及试剂 :纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司 , PCR 引物P2 5′ CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG23′,P1 5′2 ) ATTACCGCGGCTGCTGG23′由上海生工公司合成 。 () () 作者简介 :陈 灏 1978 - ,男 ,上海市复旦大学遗传所 200433,硕士研究生 ,主要从事未经培养的微生物分子生 物学研究 。 收稿日期 :2001210208 ,修回日期 :2002202222 112 方法 3 11211 土壤中抽提染色体 DNA:称取 10g 土壤于三角瓶 ,加入 1315mL DNA 抽提缓冲液( 100mmolΠL Tris2HCl , p H810 , 100mmolΠL EDTA , p H810 , 100mmolΠL 磷 酸 盐 缓 冲 液 , p H810 , ) μ() 115molΠL NaCl ,1 %CTAB,100L 蛋白酶 K10mgΠmL。将三角瓶放臵于 37 ?,225 rΠmin 摇 床 30 min 。加 115mL 20 %SDS ,65 ?水浴 2h ,每隔 15,20 min 轻轻摇动一下 。将三角瓶中 的物质移入 50mL 离心管 ,控制于室温 、5 000rΠmin ,离心 10min ,取上清液待用 。沉淀中再加入 415mL DNA 抽提缓冲液 ,015mL 20 % SDS ,振荡 10s 后 ,65 ?水浴 10min ,离心 10min 。 ( ) 重复上一步骤一次 ,合并上清 ,混匀 。再加入等体积氯仿Π异戊醇 24?1,5 000rΠmin 离心 ) ( 10min ,取水层 ;再加入 016 体积的异丙醇 ,室温放臵 1h 时 。9 000rΠmin 离心 20min 室温, (μ) 取沉淀溶解于 p H7