生物化学技2 沉淀法.pptVIP

（4）脱盐 常用方法：凝胶过滤法和透析法 透析操作的注意事项： 透析袋处理：市售透析袋要D.W洗净，检查无漏洞时再用。若用来去除某些易被金属离子或水解酶破坏的样品中的盐时，透析袋应用含EDTA-Na2的NaHCO3溶液中煮沸10min；并经D.W煮沸、漂洗后再用 透析液的选择：透析液一般为低离子强度的中性缓冲液。对含有辅基的酶透析时，宜在透析液中加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为防止微生物的生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加0.02%的NaN3 (二)有机溶剂沉淀法 1.原理 与盐溶液一样具有脱水作用，使Pro表面的水化膜破坏 降低溶剂系统的介电常数，即降低极性（而蛋白质为水溶性物质） 2.常用有机溶剂：MeOH、EtOH、Me2CO等 3.有机溶剂的使用量： V表示加入有机溶剂的体积； V0表示蛋白溶液的原始体积 S1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度) S2表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓度) C表示有机溶剂的浓度（如无水EtOH ，则C=100，95% EtOH ，则C=95） 4.注意事项： 中性盐作用。即在有机溶剂沉淀时，加入适量中性盐，一方面可增加Pro在有机溶剂中的溶解度，另一方面可防止Pro变性（μ≤0.05）；提高分级效果 低温下操作。因为有机溶剂加入水溶剂中会放热，若不注意降温，容易导致Pro变性 多价阳离子作用。有些Pro能和多价阳离子（如Zn+、Cu+等）结合形成复合物，致使Pro在有机溶剂中溶解度降低，这对在高浓度溶剂中才能沉淀的Pro特别有益。如在某些Pro溶液中加入0.005~0.02mmol/L的Zn+，就可节省大量有机溶剂， 使Pro有效得沉淀出来 （三）蛋白质沉淀法 1.碱性蛋白质（多价阳离子的碱性蛋白质） 如：鱼精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀Pro 应用：①鱼精蛋白加入到部分纯化的酵母PFK溶液时，溶液中的酶蛋白便会吸附到鱼精蛋白—核酸沉淀物上；将沉淀物用0.1mol/L磷酸缓冲液洗脱，收集的PFK纯度提高了9倍 ②从深红螺菌中分离PEP羟基激酶时，加鱼精蛋白处理，可除去其中3/4的杂蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中 缺点：多价阳离子的碱性蛋白质不可再利用，且其水溶液pH2~3，要小心调中性后才能应用 2.凝集素 目前研究得比较清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，它是一种特殊的蛋白质，主要对糖蛋白糖链末端序列有特异、明显的凝集力 例：伴刀豆蛋白—对含有G、甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异凝集沉淀作用，通过离心可把糖蛋白与一般蛋白质分离开，获得的凝集素-糖蛋白复合物用单糖作抑制剂即可解离 优点：条件温和，专一性强 3.重金属 重金属（Pb2+、Hg2+）也能与蛋白质沉淀，纯化Pro。但由于重金属易使Pro变性，故应用时要控制在较温和的条件下进行，并及时除去重金属 (四)PEG沉淀法 此法应用较广,属于非离子型聚合物引起的Pro沉淀作用;沉淀条件温和，不易引起Pro变性，且沉淀较完全 如用20%PEG-6000或57%PEG-400可使α-葡萄糖苷酶80%发生沉淀 （五）选择性沉淀 利用目的Pro与杂Pro在不同物理化学环境下的稳定性不同（如温度、酸碱度、有机溶剂等），用选择性沉淀法，使杂Pro变性沉淀，而目的Pro存在于溶液中或发生可逆性沉淀，从而使目的Pro得到纯化 例：①酵母干粉抽提液升温至55℃，20min后迅速冷却，离心除去热变性的Pro，上清液中为对热稳定的醇脱氢酶 ②假单胞菌培养液中加 HCl 调pH至4.0，得到碱性脂酶的沉淀 （六）结晶沉淀法 操作： ①将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中，加入适量的盐（如20~40% （NH4）2SO4 ）或有机溶剂（如EtOH、MeOH等），使其溶解度降低至接近饱和的临界浓度或刚刚开始出现沉淀 ②调节pH至等电点附近，控制温度4℃左右，使溶解度进一步降低 ③放置一段时间（陈化），即可得到结晶沉淀 对于难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速结晶 * * * * * 掌握沉淀类型 硫酸铵对尿素酶的沉淀作用 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 在pH7.0溶液中几种蛋白质的和K常数（溶解度S以mg/ml表示） 第二章 沉 淀 法 沉淀法是分离纯化生命大分子物质常用的一种经典方法；其特点是：操作简单，成本低廉 常见的方法有盐析、有机溶剂沉淀、蛋白质沉淀、PEG沉淀、选择性沉淀、结晶沉淀等 掌握沉淀法的基本原理及影响因素 掌握沉淀类型及其在制备蛋白质、核酸中作用原理 熟悉沉淀法