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免疫分析技术之ELISA 广东省功能蛋白质组学重点实验室 王 娟 ELISA 概念 酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）， 是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术，基础是：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 基本原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 ④由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 　 Principle Principle Principle Assays on Uniform Polystyrene(聚苯乙烯) Beads Two internal Dyes for Bead Classification Two-Color Bead-Coding Based on xMAP technology By using 10 different levels of each of two fluorescent dyes, an array of 100 beads, each with a unique color signature, is created “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well “Liquid Array” Technology Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well 反应主要包括3个步骤 探针分子的固定 将这种标记好探针的球形基质与样品反应。探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子与目的分子特异性的结合，对反应进行定量 反应结果的检测 LiquiChip Workstation Flow cytometer-based technology Measures fluorescence Components: Reader Microplate Handler Fluid Module Flow Cytometer based Analysis Beads are aligned in a single file stream by hydrodynamic focusing Two lasers are used for excitation of fluorescence Principle of Detection 系统的优点 灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，可以接受实验室已有的实验方案，使用者可以自行设计分析方案，也可使用成套试剂盒? 通量大，可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析；在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测 液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应 灵敏度高，信噪比好，只需要微量的样品即可进行检测 操作简便，耗时短，成本低? When to use the LiquiChip System? The LiquiChip System is used for a large variety of protein assays: Immunoassays Enzyme Assays Protein-protein interaction Assays Receptor ligand As