聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质新.pdfVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质 【目的】 1 ． 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。 2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 【原理】 带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率 与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺 （ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚 甲基双丙烯酰胺 （ Bis ）在催化剂 过硫酸铵 （ Ap ） 和加速剂 四甲基乙二胺 （ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而制得的 （其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联 剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶 分离血清蛋白质。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质 （见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好， 分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白 质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来 （图 3-4 ）， 是 目前较好的支持介质， 应用十分广泛。 图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。本实验采用的 盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质 的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩 （浓缩效应）成厚 度 为 10 -2 cm 的起始 区带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。 【器材】 1 ．电泳仪 直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。 2 ．垂直管型圆盘电泳装置 目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的 部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀 （ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽，可分为上下 两槽 。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流 （图 3-5 ）。 图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A 为正面， B 为剖面 ) 3 ．大号试管和中号试管 4 ．微量移液器 5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等 【试剂】 1 ．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 一般性的分析工作，用分析纯的 Acr 和 Bis 即可，精细的分析工作，尤其是分子量的测定和 定量分析，需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶，进一步纯化。 2 ． N ， N ， N ＇， N ＇ — 四甲基乙二胺 （ TEMED ） 商品 TEMED 即可，低温，避光保存。 3 ． 10% 过硫酸铵溶液 （ AP ， W/V ） 10g 过硫酸铵定容到 10ml ，最好使用新鲜配制的溶液。 4 ．染色液 取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒搅拌，待完全 溶解后，再加入蒸馏水加至 1000ml 。 5 ．脱色液的配制 取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 6 ．储备液的配制 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表： Tris 5.98g 缓冲液 1mol/L HCl 48ml PH 6.7 加蒸馏水至 100ml 浓缩胶 Acr 30.0g 凝胶储液 Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml Tris 36.3g