重组腺病毒Ad―GFP―C197的构建及其抗肿瘤活性研究.docVIP

重组腺病毒Ad — GFP — C197的构建及其抗肿瘤活性研究 端粒酶是维持端粒长度的重要组成部分，是肿瘤发生的标志 物之一。构建了能表达人端粒酶逆转录酶（hTERT） C端936-1132氨 基酸片段（C197）的重组腺病毒Ad-GFP_C197,并观察其对Hela细胞 增殖的影响。结果显示，Ad-GFP-C197感染llela细胞后，采用免疫印 迹法检测到C197在细胞内得到高效表达。此外，Ad-GFP-C197明显抑 制Hela细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并且降低Hela细胞中端粒酶活 性。上述研究为进一步研究hTERT C末端功能打下基础，并为肿瘤的 生物治疗提供新的思路。 和著作权归原 所有， 关键词：重组腺病毒；Hela细胞；人端粒酶逆转录酶；C197；细胞凋 亡；端粒酶活性 R966 A W07-7847 （2015） 03-0237-05 端粒是在染色体末端维持染色体稳定的帽状结构，含有特征性的 TTAGGG重复片段。细胞每一次分裂均会使TTAGGG片段的丢失，最终 导致DNA缺损，引起细胞死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白，能特异性 地在染色体DNA末端加上TTAGGG片段，防止端粒缩短。绝大多数人体 细胞中检测不到端粒酶的活性［1］。与此相反，在85 010的肿瘤细胞 中检测到了端粒酶活性［2］。端粒酶对肿瘤的发生发展起到重要的促进 作用［3］。 人端粒酶主要组成部分包括RNA ( humantolemerase RNA, hTR) 和逆车专录酉§ (human tclom-crasc reverse transcriptase, hTERT)。 hTR作为模板，在hTERT的作用下使端粒末端得以延长。hTERT有3 个结构域，分别是N末端部分，具有逆转录活性的中间部分(逆转录 区)，以及一小段C末端序列［4］。N末端主要是与hTR结合部位，C 末端主要是与DNA结合部位，这两部分是hTERT与其他逆转录酶的主 要区别。逆转录区是催化活性部位，几乎所有的逆转录酶在该区的活 性基团都高度保守。目前对hTERT不同片段的研宄较多的是将hTERT 的N末端和逆转录区的保守基因进行缺失突变或识别hTERT自然存在 的不同mRNA剪切体，观察这些突变体或剪切体对肿瘤细胞增殖的影响 和端粒酶活性［5-7］。另外，一些剪切体可以翻译成蛋白质，表现出不 同的生理和病理功能，如抑制细胞增殖、抑制Wnt信号途径等端粒外 功能［8, 9］。 目前对hTKRT C末端的研究较少，有研究表明，hTERT的C末端 可调节hTERT在细胞内定位［10］，对端粒酶的功能不可或缺［11］。在 前期的研宄中，我们曾经构建了表达hTERT C末端197个氨基酸(hTERT 936-1132, C197）的真核表达质粒［12］，但表达量不高。在此基础上， 本研究构建Y能大量表达C197片段的重组腺病毒Ad-GFP-C197.为进 一步研究hTERT的C末端功能打下基础。同时还发现，过表达C197 可明显抑制llela细胞增殖，促进其凋亡，降低细胞端粒酶的活性，为 肿瘤的生物治疗提供新的思路。 1材料与方法 1.1材料1 .1.1菌种、细胞系、载体 BJ5183、DH5a、HEK293细胞、Hela细胞、重组腺病毒系统 AdFJasy-1 （包含骨架质粒PAdEasy-1和穿梭质粒PAdTrack-CMV）均 由本实验室保存。 1. 1.2实验试剂和设备 胎牛血清、高糖培养基购自美国Hyclonc公司；Sail和Ecor V 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Ex -Tag酶、Pme I酶、Pacl酶均购 自美国Thermo公司；小景质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂 盒均购自美国OMEGA公司；Trizol试剂盒购自上海生物技术有限公司; 台盼兰试剂盒购自碧云天公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司； PVDF膜、TRAP法端粒酶活性检测试剂盒均购自美国Milliporc公司; ECL显色试剂盒购自美国Thermo公司；EB溶液购自美国Sigma公司； 6-his tag抗体、凝胶成像分析仪（美国Kodak公司）；GDPDH抗体、 羊抗鼠IgG二抗均购自美国Santa公司；细胞恒温培养箱（美国Thermo 公司）；高速离心机（美国Backman公司）；焚光倒置显微镜（口本Nikon 公司）。 1.2方法 1.2.1 0的基因获取 根据GenBank公布的人hTERT基因序列，选取C端936-1132氨基 序列片段（命名为C197），在该片段中的C端引入EcorV限制性酶切 位点，在N端引入6个his标签和Sail限制性酶切位点，片段总长度 为650 bp，合成后克隆至PGSI载体（上海生工公司合成）。 1.2.2重组腺病毒大