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动物细胞培养理论教授
动物细胞培养实验理论讲授(II)
指导教师:费晓方
2014年6月
传代细胞培养实验
---贴壁细胞HeLa细胞传代培养
实验目的和要求:
掌握无菌操作技术。
掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。
掌握贴壁细胞传代过程中的消化分散技术。
熟练细胞计数方法。
了解培养液配制方法。
熟练倒置显微镜的使用。
本次试验应用HeLa细胞或A375-S2细胞进行传代培养。
HeLa 细胞:人子宫颈癌细胞株
A375-S2细胞:人黑色素瘤细胞株
实验材料:
每组的超净台中备有以下物品:
1.材料
50ml RPMI1640培养液1瓶;
5ml小牛血清(FCS) 1瓶;
2ml胰蛋白酶 1瓶;
1ml谷氨酰胺 1瓶;
1ml Hepes 1瓶;
PBS(-)1 瓶
实验材料:
每组的超净台中备有以下物品:
2. 器材
灭菌1ml移液管 1支;
装有试管的灭菌小饭盒 1个;
试管架1个;
1ml ,200μl移液器各1支;枪头盒2个;
细胞计数板1块;
镊子1把,小烧杯1个;
酒精灯1台;
培养好细胞的细胞培养瓶1个
实验操作步骤:
:
1.超净台灭菌,打开风机,点燃酒精灯,消毒双手准备操作。
2.从培养箱中取出细胞,在显微镜下观察细胞形态。
3.配置应用培养液(含有10%小牛血清,1%谷氨酰胺,PH7.2-7.4的RPMI1640培养液)待用。
4.倒掉原有的细胞培养液,加入5mlPBS(-)洗涤2次。(注意:每次操作要用酒精灯对培养瓶口进行灼烧,两个容器瓶口不能接触)
5.加入胰蛋白酶100-200μl,迅速前后旋转细胞培养瓶4-5次,以便胰蛋白酶包被所有细胞,于37°C 培养箱中孵育5分钟,消化细胞。
实验操作步骤:
6.在显微镜下观察细胞变化,待细胞渐渐变为球形,尚未从培养瓶壁上脱落下来时,用移液管吹打,使细胞从培养瓶壁上脱落下来(或用手掌左右来回轻敲培养瓶的侧壁,使细胞从瓶底面脱落下来),再加入细胞培养液2-5ml。
7.如果细胞不能吹打下来,再放回培养中孵育几分钟。
8.倒入50ml离心筒中,在向细胞培养瓶中加入10ml培养液洗涤,在一并倒入离心筒中,1000-2500转离心,10分钟。
9.取出离心管,倒掉上清液,在桌面上轻敲离心筒,使沉降在离心筒底的细胞分散均匀。
实验操作步骤:
10.倒入5ml细胞培养液,混匀。细胞计数。
11.取1105个细胞放入细胞培养瓶内,加入5-8ml培养液。
12.显微镜下观察。
13.将传代细胞放入培养箱中培养。
14.两天后显微镜下观察细胞生长情况。
原代培养实验理论讲授
---小鼠胚胎成纤维细胞原代培养
实验原理:
原代细胞培养
是将机体内的某组织取出,分散成单细胞,在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老,死亡等生命现象。
成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分,由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。成纤维细胞较大,轮廓清楚,多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构,其细胞核呈规则的卵圆形,核仁大而明显。
· 根据不同功能活动状态,可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞,成纤维细胞功能活动旺盛,细胞质弱嗜碱性,具明显的蛋白质合成和分泌活动,在一定条件下,它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。
成纤维细胞:是从成年小鼠身上提取
成纤维细胞。
胚胎成纤维细胞: 是从小鼠胚胎中提
取的成纤维细胞。
胚胎成纤维细胞的活性和繁殖能力 比成纤维细胞更好。
小鼠胚胎成纤维细胞
掌握无菌操作技术。
掌握组织细胞的消化与分散。
熟悉原代细胞培养的一般方法与步骤。
熟悉小鼠解剖操作技术。
实验目的和要求:
动物的选择:
选择大约一半足孕时间的胚胎,10-13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞,胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎2-5个
实验材料:
每组的超净台中有以下物品:
1. 50ml 配制好的RPMI1640(或DMEM)培养液1瓶;8ml小牛血清(FCS) 1瓶;100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶;PBS(-)(生理型磷酸盐缓冲液)1 瓶
2. 100ml灭菌烧杯2个;
3、50ml离心筒2个
4、灭菌培养皿1个,细胞培养瓶1个
4、1ml ,200μl移液器各1支;枪头盒2个;无菌玻璃搅拌棒1个
5、细胞计数板1块;
6、灭好菌的镊子1把,剪刀1把;
7、酒精灯1台;
试验操作步骤:
1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
a.采用认可的方案处死啮齿动物。
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