串联亲和纯化技术的研究进展.pptVIP

最初人们广泛采用上述的C末端TAP标签，后来，随着研究的深入，研究者，发现C末端多肽的引入会严重损害一些目的蛋白的功能,产生生长缺陷甚至死亡， 并将融合蛋白载体平行导入单倍体和二倍体细胞加以验证，仍不能解决以上问题。 3.1.1 N末端TAP标签 3.1 标签系统的改进 为了处理上述问题，Puig等发展了N末端 T A P标签，如图3所示.N末端T AP标签具有与C末端TAP标签相同的模体，但模体顺序却是相反的。为了使 Prot A模体 在第一步纯化中便于切除，N端TAP标签基因后紧接靶基因，同时，在N末端 T A P标签的CBP模体后加入一肠激酶( E K) 切位点 ，便于从融合蛋白中去除标签残基。 当不同复合物的两个亚基存在协同作用并可形成一个新的复合物时，由于其相互作用的部分较小，大部分亚基仍保持游离状态或两个亚基主要是与其他复合物蛋白紧密结合。 用分离式标签可将这一含量稀少的特定复合物分离出来。它的策略是将 TAP标签的模体分开，分别融合于两个亚基即一个亚基同 P rotA与TEV模体融合，而另一个与 C B P融合。如图4所示，第一次亲和纯化时，仅包括 CBP模体的非特定复合物因不能结合 I gG珠而被除去，经 1 ’EV蛋白酶处理后，再进行第二次纯 化时，只有当两个靶亚基相互作用形成复合物后，才能结合于亲和柱上并被分离。 3.1.2 分离式标签 当两个复合物