实验四过氧化物酶几固定化方法的比较.pptVIP

实验四、过氧化物酶几种固定化方法的比较 石陆娥 shilue@126.com 实验目的 1.了解酶的固定化方法及原理； 2.掌握过氧化物酶的凝胶包埋法固定化方法，了解交联吸附法固定化方法。 实验原理 目前随着酶工程的不断发展，酶在医药、食品、轻工、化工、环境保护和科学研究等方面得到了广泛应用。酶具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著优点，但是在使用上存在着一些不足之处，如稳定性差、不能重复使用、反应产物不易分离等。针对酶催化的不足之处，人们不断研究寻求酶高效利用的方法。目前研究和应用最多的方法是酶的固定化技术。 酶的固定化方法有吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法。包埋法是其中操作较为简便，应用也较为广泛的一种。它是通过将酶包埋在各种多孔载体中（高分子凝胶或高分子半透膜），使酶固定化的方法，常用载体有琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明胶、胶原、和卡拉胶等高分子化合物。包埋法的显著优点是酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少。 实验器材 试剂： 1、酶液：实验一提取所得； 2、3%海藻酸钠溶液： 称取6g海藻酸钠溶于200ml蒸馏水中，于70℃ 加热完全溶解，冷却待用。 3、1%乙酸溶液 4、10.0 %NaOH溶液 5、95 %乙醇 6、0.20 %戊二醛溶液 仪器：水浴锅、天平、针筒、针头、移液管、量筒、 玻璃棒、分光光度计、磁力搅拌器。 实验步骤 1） 海藻酸钠包埋法 15ml 酶液加入到15ml 3%海藻酸钠溶液中，混合均匀，用针头缓慢的逐滴滴入50ml CaCl2（浓度为0.05mol/L）溶液中（冰浴中），边滴边搅拌，4℃静置30min，过滤，收集滤液，量体积测酶活，称海藻酸钠颗粒重量，测定固定化酶活力。 滤液酶活测定参考实验一，海藻酸钠固定化酶活力测定如下：向50ml烧杯中加入 13mL 缓冲液Ⅱ，0.5mL 邻苯二胺-乙醇溶液，1mL 0.3%过氧化氢溶液，然后加入X g（自己换算需要加入多少克）固定化酶 能等同于（0.5ml酶液），并立即搅匀计时，反应5min后在 430 nm下测定反应混合物的吸光值，测好后，把比色皿里的溶液倒入烧杯，继续摇晃，反应10min后在 430 nm下测定反应混合物的吸光值。同时需要测定原酶液的酶活，空白以缓冲液代替酶液。根据吸光值变化情况调节加酶量，最终吸光度应在0.1-0.9范围内。 2）壳聚糖微球交联吸附法 （1） 壳聚糖微球的制备 壳聚糖0.75 g溶于25 mL，1.0 %乙酸溶液中充分溶解，将20ml壳聚糖溶液逐滴滴入100ml混合液（10.0 % NaOH与95 %乙醇，体积比为4∶1），得粒度均匀、形状规整的壳聚糖微球，过滤收集壳聚糖微球，再用蒸馏水洗涤至中性，湿态保存。 （2）壳聚糖微球的交联 将上述壳聚糖微球置于0.20 %戊二醛溶液中，室温下恒温振荡2.0 h，用大量水反复洗涤，以去除残留的戊二醛溶液，即得壳聚糖微球载体。 （3） 过氧化物酶的固定化 将制得的壳聚糖微球载体，加入15ml过氧化物酶溶液中，4℃冰箱固定化过夜。过滤，测量滤液体积及活力，载体用0.05 mol/l pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤，即得固定化过氧化物酶。测定原酶液、滤液、固定化酶活力，固定化酶活力测定参考海藻酸钠固定化酶测定方法。 3）以DEAE纤维素为载体的固定化方法 将1.0 g DEAE放入到30 ml pH 7.0（0.05mol/l）的磷酸盐缓冲溶液中，加入1.2 ml（25 %）戊二醛溶液搅拌2.0 h，挤滤，用磷酸缓冲液洗去过量的戊二醛溶液，取上述经过活化的DEAE，加入到15ml酶液中，4℃冰箱固定化过夜，得固定化酶。过滤，测量滤液体积及活力，载体0.05 mol/l pH 7.0的磷酸缓冲液反复洗涤，即得固定化过氧化物酶。测定原酶液、滤液、固定化酶活力，固定化酶活力测定参考海藻酸钠固定化酶测定方法。 数据处理 计算三种酶固定化方法的酶结合效率及活力回收率。 思考题 1.酶固定化方法有哪些？ 2.游离酶与固定化酶优缺点比较？ 3.试分析比较上述三种方法的优缺点？ *