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双水相萃取 双水相的形成 双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS) PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖(dextran) 1、Pro如何分布 2、影响因素 3、应用 ATPS相图 双节线(bi-nodal)： 图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线(tie line)： 双节线上两点的直线。 系线反映的信息 A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则 B 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小. C 临界点(critical point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。 双水相萃取的理论基础 1)分配系数m 2)m贡献因子 me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献. 静电作用 非电解质型溶质:电中性蛋白质的m0： 式中, M: 溶质分子量; ??: 溶质在上下两相表面自由能的差, J/mol。 意义： A 不受静电作用的影响(因不带电); B 一般?? 0，不同溶质lnm随M? 而?； C ATPS不同, 同一溶质的??也就不同，m随ATPS不同而改变。 图是不同pro在pH为各pro的pI的ATPS中的m, 道南电位(??, Donnan potential) 实际ATPS中有电解质, 当这些离子在两相中m ? 1), 将两相间产生电位差?? 带电pro的m: 意义： A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比. B 由于同一ATPS中添加不同的盐产生的??不同,故m与Zpro的关系因盐而异。 影响物质分配平衡的因素 1)成相聚合物浓度和分子量 分子量M: 若降低聚合物的M，则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统，若降低DX的M，则m减小。这一规律具有普遍意义。 成相系统的总浓度：增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相. . 存在问题：当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附.这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质.这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。 2)盐 ??：图为各种离子在PEF/DX系统中的m. 图示：HPO42-和H2PO4-(H1.5PO4-1.5)离子在PEG/DX系统的m小, 因此利用pH 7的磷酸盐buffer很容易改变??,使带负电pro有较高的m. ?HFS：盐的种类和浓度影响pro的?HFS, 从而影响pro的m。当盐的浓度很大时(如1mol/dm3), 由于强烈的盐析，蛋白质的溶解度达到极限，表现分配系数增大，此时m与pro浓度有关。利用这一特点，通过调节ATPS盐浓度，可选择性萃取不同的pro。 不良影响：改变各相中成相物质的组成和相体积比。如PEG/Kpi系统中上、下相(或称轻重组)的PEG和磷钾浓度。 3)、pH value A (pH – pI) value pro(?Z) lnm 4) 温度 温度影响小, 一般温度改变不影响产物的萃取。 大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于： (1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性; (2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3) 常温操作节省冷却费用. 在上述理论基础上,设计合理的试验,可确定最佳萃取系统. 双水相萃取放大容易: 一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模. 因此,常利用多组10ml刻度离心管,进行分配平衡实验. 具体实验步骤如下. (1) 配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相, 每个双水相改变一个参数. 其中pH通常用磷酸盐缓冲液或氨酸调节. (2) 加入料液, 再加水使整个系统质量达到5~10g.离心管封口后充分混合; (3) 在1800~2000g下离心3~5min,使两相完全分离; (4) 小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出,测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性, 计算分配系数. 上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差。 19.5应用 1) 蛋白质、酶的纯化 2) 多肽的分离纯化 3) 核酸的分离纯化 4)、