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第三章 蛋白质化学(三） Proteion Chemistry 蛋白质的大小、形状及分子量 变性作用与复性作用 两性电离与等电点 胶体性质 沉淀作用 蛋白质的颜色反应 1.根据化学组成测定最低相对分子量 测定方法 测几种标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）的Ve（洗脱体积）。以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线。 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量 标准蛋白质和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），否则不能得到比较准确的Mr。 3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量(SDS－PAGE) 电泳过程中有3种物理效应： 样品的浓度效应； 对被分离分子的筛选效应； 电荷效应。 迁移率大小： 分子大小 分子形状 净电荷（荷质比） 用途：用于测定蛋白质样品的纯化程度、蛋白质的相对分子质量和蛋白质中多肽亚基的数量。 β-巯基乙醇：HO – CH2 – CH2 - SH 能打开二硫键. SDS：是蛋白质变性剂，可使蛋白质变性（肽链伸展），破坏氢键和疏水键。 SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合，形成SDS-蛋白质复合物，每2~3个氨基酸残基结合一个SDS分子。 结果：均带负电，且荷质比相同具有相似的构象。 在电场中移向正级。分子量大的泳动慢，小的泳动快。 测定方法 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。 测出待测样品的迁移率。 从标准曲线上查出样品的相对分子质量。 （一）分离原理与程序 （二）蛋白质的分离纯化方法 1.根据分子大小不同的纯化方法　 ①透析和超过滤 ②凝胶过滤（分子排阻、凝胶过滤层析、凝胶渗透层析） 2.利用溶解度差别的纯化方法 在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 分子所带电荷的性质和数量； 亲水基团与疏水基团的比例，以及它们在蛋白质分子表面的排列。 方法： 等电点沉淀：等电点溶解度最小，配合其他方法使用。 盐析 低温有机溶剂分离法 ①蛋白质的盐析　　 盐析：当中性盐浓度较高时，降低蛋白质的溶解度，使蛋白质发生沉淀。这种现象称为盐析。盐析沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。 中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）对蛋白质的溶解度有显著的影响. ②有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。蛋白质在有机溶剂中的溶解度随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同。 优点：选择性高，不需要脱盐 3.根据分子电荷不同的纯化方法　 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物 电泳 离子交换层析 ①聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE，圆盘电泳） ②醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 ③离子交换层析　　　　　97页 基本原理：同氨基酸分离，蛋白质的分离基于它的总净电荷。 支持介质：纤维素离子交换剂和交联葡聚糖离子交换剂。 阴离子交换层析：用于带负电荷蛋白质的分离。 　　DEAE－纤维素或DEAE－葡聚糖Sephadex) 阳离子交换层析：用于带正电荷蛋白质的分离。 　 　　CM－纤维素或CM－葡聚糖 蛋白质对离子交换剂的结合力取决于： 彼此间相反电荷基团的静电吸引 与溶液的pH有关 保持洗脱液不变、分段洗脱、梯度洗脱、改变pH 对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先被洗脱下来 ④利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法　309页 层析系统图示 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 （一）蛋白质的含量测定 ①凯氏定氮法 ②双缩尿法 ③ Folin-酚试剂法 ④紫外吸收法 ⑤考马斯亮蓝结合法等。 （二）蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 本章重点 simple protein 清蛋白和球蛋白:广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 谷蛋白和醇溶谷蛋白:植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。 精蛋白和组蛋白:碱性蛋白质,存在于细胞核中。 硬蛋白:存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中,分角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白 蛋白质的分类－－组成 conjugated protein 色蛋白:与色素物质结合而成,如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 糖蛋白:与糖类物质组成,如细胞膜中的糖蛋白等 脂蛋白:与脂类结合而成,如血清?,?-脂蛋白等 核蛋白:与核酸结合而成,如细胞核中的核糖核蛋白等。 黄素蛋白:与黄素核苷酸结合而成,如琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶 金属蛋白: