课件：时间分辨荧光分析法 - 副本.ppt

2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。 2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 +包裹于其内部的微胶囊(胶态分子团) 。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于测定蛋白质类大分子化合物。 2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、甲状腺激素类和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔壁,制成固相抗原. 四、时间分辨荧光分析法的应用 1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过程中起重要作用。因此,准确测定细胞因子含量,对于了解它们病理生理作用是十分重要的。 1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病中起作用,临床上常检测补体C3来评价免疫系统的功能。 2.在微生物方面的应用 由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的理论形成后, 研究重点放在试剂开发和利用上； 1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗体TRFIA方法. 3.分子生物学的应用 标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核酸杂交整个过程变得快速、简单。目前,稀土元素标记探针技术已用于检测HIV、检测前列腺特异性抗原( PSA)的mRNA、腺病毒DNA、肺炎链球菌DNA和HLA227等位基因,获得了满意的结果。 4.在激素方面的应用 用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测动物的激素; TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分析促甲状腺激素(TSH)、胰岛素 (Ins)、TT3、雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。 现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌素等各个方面。 五、时间分辨荧光分析法在真菌毒素检测方 面的应用 1.真菌霉素概述 真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对食品、农作物及饲料等污染很严重。 当前，最主要的真菌毒素主要有: 黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、T-2 毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。 . 2.真菌毒素的测定方法 ? 目前，真菌毒素的测定方法有 TLC 法、HPLC 法等，这些方法都不同程度地存在着样品前处理过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点。由于其他荧光物质、色素、结构类似物对检测产生干扰，必须通过液-液萃取进行净化处理，操作烦琐，有机试剂用量大，提取效率低，环境污染严重。 ? 酶联免疫分析法（ELISA）灵敏、且快速、低成本，但 ELISA是一种定性或半定量的方法，当选择的不同单克隆抗体，会造成结果存在一定的误差，所以这种定量，相对不太准确。 ? TRFIA 具有排除其他荧光干扰，灵敏度高，一次可以测多个样品的优势，将成为检测真菌毒素的主要方法. 3.实例分析：黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光免疫分析 黄曲霉毒素（Aflatoxins）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）的某些菌株产生的。黄曲霉毒素有四种类型：B1，B2，G1 和G2。另外还从牛奶中分离出黄曲霉毒素的两种代谢产物M1、M2。黄曲霉毒素常存在于花生、核桃等坚果中，在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常被发现。黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1（AFB1）最为多见，其毒性和致癌性也最强，AFB1 的毒性比氰化钾大10 倍，比砒霜大68 倍。 AFB1 干扰信息RNA 和DNA 的合成，是在翻译水平上干扰了蛋白质生物合成，影响细胞代谢，因而它与人类及动物的许多疾病存在着联系。 AFB1引起人的中毒