高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅰ介导HBV去甘露糖修饰以逃逸树突状细胞DC-SIGN免疫识别的研究-内科学(感染病学)专业论文.docxVIP

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文  PAGE 31 万方数据 高尔基体 α-甘露糖苷酶Ⅰ介导 HBV 去甘露糖修饰以逃逸 树突状细胞 DC-SIGN 免疫识别的研究 中文摘要 目的： 探寻高尔基体 α 甘露糖苷酶Ⅰ(Golgi MⅠ)介导的 HBV(乙型肝炎病毒)的去甘露糖 修饰，是否能使病毒逃逸树突状细胞(DCs)表面 DC-SIGN 的免疫识别及其机制。将 DC-SIGN 基因沉默后，观察 DCs 在野生型 HBV 或高甘露糖型 HBV 刺激下的免疫指 标，研究野生型 HBV 与高甘露糖型 HBV 对 DC 的成熟和免疫活化的影响，以及 DC-SIGN 在 HBV 感染中发挥的免疫作用。在课题组既往实验的基础上，通过寻找可 能存在于 HBe 功能蛋白基因序列中的促进宿主细胞 Golgi MⅠ活性的核心片段，来初 步探讨 Golgi MⅠ相关的 HBV 去甘露糖修饰，通过何种机制逃逸 DC-SIGN 对 HBV 的免疫识别及阻碍 DCs 免疫活化。 方法： 一、树突状细胞 DC-SIGN 的基因沉默及其对树突状细胞免疫功能的影响 1. 分离健康人的外周血单个核细胞(PBMC)进行体外培养，以 GM-CSF、 白细胞介素 -4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)将其诱导分化为 DC； 2. 构建 DC-SIGN 基因沉默的 siRNA 序列，分组转染 DC 细胞； 3. RT-PCR 法检测 DC 细胞内 DC-SIGNmRNA 的表达，流式细胞术检测 DC 细胞表面 DC-SIGN 的表达，选择 DC-SIGN 沉默效果最好的序列进行后续试验； 4.空白对照组、DC-SIGN 基因沉默组与转染无关 siRNA 序列组的 DC 细胞，以流式细 胞术检测表面分子 CD80、CD83、CD86、CDla、HLA-DR 的表达； 5. ELISA 法检测 4 中所述三组 DC 细胞分泌细胞因子 IL-10 与 IL-12p70 的水平； 6. MTT 法检测 4 中所述三组 DC 细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力； 7. Westernblot 法检测 4 中所述三组 DC 细胞内 NF-кB p65 与 p38 的表达；  二、野生型与高甘露糖型 HBV 对 DC-SIGN 基因非沉默与沉默的树突状细胞免疫功 能的影响 1. 体外培养 HepG2.2.15 细胞； 2. 加入基夫碱母液至 HepG2.2.15 细胞中，使基夫碱终浓度为 5ug/ml，如此处理 5 天 后收集 HepG2.2.15 培养上清液； 3. 通过低温超速离心法，从基夫碱处理的 HepG2.2.15 细胞提取获得高甘露糖型 HBV 颗粒，从 HepG2.2.15 细胞提取获得野生型 HBV，并以荧光定量 PCR 法检测 HBV DNA 滴度??? 4. 体外培养 PBMC 并诱导分化的 DC 分为 DC-SIGN 沉默与非沉默两组，每组三个亚 组：对照组、加野生型 HBV 组，加高甘露糖型 HBV 组。在 DC 培养第 5 天将收获 HBV 颗粒(调整浓度为 5×106copies/ml)，加入到相应组的培养基中，培养至第 7 天时， 进行如下检测； 5. 流式细胞术检测上述 6 个亚组中 DC 细胞表面分子 CD80、CD83、CD86、CDla、 HLA-DR 的表达 6. ELISA 法检测上述 6 个亚组中 DC 细胞分泌细胞因子 IL-10 与 IL-12p70 的水平； 7. MTT 法检测上述 6 个亚组中 DC 细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力； 8. Westernblot 法检测上述 6 个亚组中 DC 细胞 NF-кB p65 与 p38 的表达； 三、HBe 基因片段中促进 Golgi MⅠ活性的核心序列质粒的构建与鉴定 1.取出本实验室保存的采用分子克隆的方法构建并鉴定过的 HBe 功能蛋白的真核表达 载体(质粒)，分析表达的 HBe 蛋白结构域； 2. Wingene 软件分析酶切位点，将 HBe 质粒的基因序列切分为三段目的序列，分别 在每段序列的上下游加入酶切位点 Xho I，BamH I。设计各序列引物，PCR 扩增，将 目的片段连接载体 pEGFP-N1，构建分别包含三个表达 HBe 亚片段的真核表达载体， 依次命名为 HBe-1、HBe-2、HBe-3，分别进行测序鉴定； 3. 将上述 3 种含 HBe 亚片段的质粒和含 HBe 全长的质粒分别经 Lipofectamine2000 转染进入 HepG2 细胞内，设置空白对照组，用荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋 白的表达；  RTPCR 方法检测转染上述各质粒后 5 组 HepG2 细胞 Golgi MⅠ的 2 种