课件：克霉唑对口腔癌的影响.ppt

1、CCK-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色（甲臜）染料能够溶解在组织培养基中，生成的染料量与活细胞数量成正比,用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。 造成了周期停滞在G0/G1，Ｓ期比例下降 ANNEXIN V-FITC可以染色早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞，PI可以染色凋亡晚期细胞。 结果：克霉唑诱导细胞凋亡 显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡细胞Bax的表达。 cleaved caspase- 3 阳性表达为细胞 浆染成棕黄色的细胞 The In Vitro and In Vivo Antitumor Effects of Clotrimazole on Oral Squamous Cell Carcinoma 汇报人:于金钊 2016.8.4 通讯作者：程斌 单位：中山大学光华口腔医学院副院长 汇报内容: 一、背景 二、目的 三、方法 四、结果 五、讨论 六、结论 一、实验背景 1、克霉唑，咪唑类抗真菌药物。20世纪80年代开始应用于口腔念珠菌病，皮肤感染及免疫力低下病人口咽念珠菌病的预防。 2、克霉唑已经发现对多种肿瘤有抗肿瘤的作用，如肺癌，大肠癌，乳腺癌和子宫内膜癌。但大都是腺癌。对鳞癌的研究较少。 3、口腔鳞状细胞癌是最常见的口腔恶性肿瘤，占80%-90%，五年生存率在最近几十年没有显著改善。因此寻找新的有效的抗癌药物是非常必要的。 二、实验目的 本实验旨在探究克霉唑对OSCC的影响，以及可能的抗肿瘤机制。 三、实验方法及结果 1、体外实验： 选取CAL-27、SCC-25、UM1三种OSCC细胞系，用不同浓度的克霉唑溶液处理 1)细胞生存能力试验 2)细胞集落形成试验 3)细胞周期检测 4)凋亡分析 5)蛋白质印迹：Bax、Bcl-2 2、动物实验： 选用CAL-27建立裸鼠皮下移植瘤模型 5*106 背部皮下 ? 10天后分成治疗组、 对照组 腹腔内注射克霉唑，6次/周，2周 腹腔内注射花生油，6次/周，2周 1）肿瘤体积 2）肿瘤重量 3）免疫组化：增殖细胞核抗原（PCNA）、cleaved caspase- 3 4）蛋白质印迹：Bax、Bcl-2 1、细胞生存能力试验（CCK8） 不同浓度的克霉唑溶液与细胞共培养后，加入CCK8，检测OD450 结果：克霉唑以剂量依赖型和时间依赖型模式，在全部三种OSSC细胞系中抑制细胞增殖 2、细胞集落形成试验： 将OSCC接种到不同浓度的克霉唑的培养基中，培养2周。之后固定、染色，光镜下观察，大于50个细胞的群落参加计数。 克霉唑显著降低了体外群落形成。 3.细胞周期检测： 细胞先后进行饥饿处理和不同浓度的克霉唑溶液处理，之后收集固定，并用RNase A 处理，清除RNA,PI染色DNA.周期分布用流式细胞仪测定。 造成了周期停滞在G0/G1，Ｓ期比例下降 4、凋亡分析： 不同浓度克霉唑溶液处理细胞后，用Annexin V-FITC/PI双染染料染色，流式细胞术进行凋亡数据的收集和分析 结果：克霉唑可以诱导细胞凋亡 5、蛋白质印迹分析： 对照组（DMSO溶液）和实验组（40uM克霉唑）溶液分别处理细胞12h，24h，48h，将细胞裂解，收集总蛋白，测定蛋白含量，电泳，免疫反应。 显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡细胞Bax的表达。 二、动物实验 1、肿瘤体积和瘤重 在CAL-27异位移植瘤模型中，显著抑制了肿瘤生长 2、免疫组化：PCNA、凋亡蛋白 cleaved capase- 3 克霉唑能抑制裸鼠肿瘤中PCNA的表达 克霉唑可以上调凋亡蛋白 cleaved capase- 3的表达 3、蛋白质印迹： 显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡细胞Bax的表达。 实验结果： 1、克霉唑以剂量依赖型和时间依赖型模式，在全部三种OSSC细胞系中抑制细胞增殖，同时显著降低了体外群落形成。 2、导致周期停滞在G0/G1期 3、诱导细胞凋亡，显著抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表达，上调促凋亡细胞bax的表达。 4、在CAL-27异位移植瘤模型中，显著抑制了肿瘤生长和细胞增殖，显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡细胞Bax的表达。 四、讨论： 这篇文献第一次将克霉唑的促凋亡作用与Bcl-2家族联系起来，但具体通路不明确，后续需要继续研究。 动物模型为之后的动物实验奠定了基础，如化学诱导模型。 五、结论： 克霉唑在体内和体外试验中都有潜在的抗口腔癌作用。 * 高等教育 * 1、CCK-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色（甲臜）染料能够溶解在组织培养基中，生成的染料量与活细胞数量成正比,用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间