GB 15193.20-2003TK基因突变试验.pdf

ICS 07.100 C 53 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB 15193.20-2003 TK基因突变试验 TKgenemutationtest 2003-09-24发布 2004-05-01实施 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 中 发 布 国国家标准化管理委员会 GB 15193.20-2003 前 言 本标准全文强制。 本标准参考美国FDA营养素补充剂与食品安全中心食品添加剂安全办公室发布的“食品成分安 全评价毒理学原则2000年版红皮书(2001年9月发布):IV.C.Lc.小鼠淋巴瘤胸腺嗜吮激酶基因突 变试验(IV.C.1.c.MouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssay). 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:四川大学华西公共卫生学院、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。 本标准主要起草人:张立实、张建清、帅培强、王怡净。 本标准首次发布。 GB 15193.20-2003 TK基因突变试验 范围 本标准规定了体外哺乳类细胞TK位点基因突变试验的基本技术要求与方法 本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、 生物和物理因素的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂(含营养强化剂)、食品新资源及其成分、新资源 食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业 用微生物等。 2 原理 TK基因突变试验的检测终点是胸昔激酶(thymidinekinase,TK)基因的突变。在人类，TK基因 定位于17号染色体长臂远端;在小鼠则定位于11号染色体。故TK基因的突变属于常染色体基因 突变。 TK基因的产物胸昔激酶在体内催化从脱氧胸昔(TdR)生成胸昔酸(TMP)的反应。在正常情况 下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嚓吮核昔酸(dUMP)，即由胸昔酸 合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加人胸昔类似物(如三氟胸昔，即 TFT一一trifluorothymidine)，则TFT在胸普激酶的催化下可生成三氟胸昔酸，进而掺人DNA,造成致 死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸昔激酶缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺 人DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数，计 算突变频率，以判定受试物的致突变性 3 试剂与材料 3.1细胞:L5178Ytk-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。为清除自发突变的tk-/一基因型细胞，在正式实验 前，应使用含3pg/mI胸昔,5pg/ml一次黄嗦吟,0.1pg/mL氨甲碟吟和7.5pg/mL甘氨酸的THMG 培养基中处理24h,离心、洗涤后在不含氨甲碟岭的THMG培养基中培养3天。 3.2 试剂:PBS磷酸盐缓冲液，三氟胸昔(trifluorothyrnidine)，次黄嗓吟(hypoxanthine)，甘氨酸(gly- cine),氨甲碟吟(methotrexate)，胸腺嗜吮核昔(thymidine)，阳性对照物(MMS,MMC，环磷酞胺等) 4 试验设计 一般应进行细胞毒性预试验，根据预试验结果，在相对存活率((relativesurvival,RS)为明性对照组 的20%-80%范围内设3个一4个剂量(浓度)水平。每次试验均需设阴性(双蒸水)对照，通常亦需设 阳性对照。阳性对照通常使用MMS,EMS,MMC,CP环磷酞胺)等。如使用非水溶剂，则亦