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实验六、 植物组织DNA的提取 王欢欢 二零一二.十 转基因作为一个外源DNA序列，在植物基因组中的整合方式如何？整合后的转基因结构和拷贝数是否变化？ 转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复制过程整合到核基因组中。转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的，外源DNA可以插入植物基因组的任何一条染色体，也可以插入一条染色体上的任何位点，但在转录活跃区具有优先插入特性。 核DNA分子呈极不对称的线状结构，对任何机械力的作用都十分敏感，在分离纯化过程中，DNA分子的降解很难避免，因而，我们分离得到的只不过是植物核DAN分子的片段。 总DNA提取不必分离细胞核及细胞器，用温和的方法使细胞破碎后，核蛋白体自然释放出来。 破碎细胞 加去污剂使核蛋白解析 使蛋白质变性沉淀 DNA被抽提 酒精沉淀 DNA RNA的去除 2×CTAB法提取植物组织DNA DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。 CTAB(Cetyltrimethyl ammonium-bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液是可溶的（0.7mol/L NaCl ）。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 CTAB法最大优点是通过高盐缓冲液的选择性沉淀能很好去除糖类杂质。 二价离子螯合剂EDTA可消除外源及内源的DNase活性。 SDS法：利用高浓度SDS，较高温度裂解细胞，是染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀。操作温和简单，但所得产物糖类杂质较多。 2×CTAB法 100 mM Tris·Cl (pH 8.0) 20 mM EDTA 1.4 M NaCl 2% (w/v) CTAB * 1% (w/v) PVP * 使用前加0. 2 % 巯基乙醇 PVP：聚乙烯吡咯烷酮。防止褐化 巯基乙醇：在DNA提取过程中防止细胞内物质发生褐变对实验结果产生影响。其主要作用是降低氧对细胞产生的氧化损伤。 植物总DNA提取时如何使植物细胞壁有效破碎的同时尽量保持DNA的完整？ 冷冻干燥的材料容易粉碎 冷冻干燥下DNase活力极低，研磨不会引起DNA降解。冷冻干燥的材料在脱水状态下储存几年DNA不会有明显变化。 2× CTAB法提取烟草叶片DNA 期间轻柔混匀几次 有必要可以重复一次 DNA琼脂糖电泳(1%) DNA提取注意事项 植物材料表面如有杂质要擦拭干净，水分要用滤纸吸干，否则液氮速冻会形成冰晶而妨碍研磨。 研钵加液氮前必须干燥，并先用液氮预冷 研磨要充分，至叶片粉末接近白色 研磨样品尚未解冻时添加提取Buffer，尽量减少暴露空气的时间，如果融化，内源DNase会引起DNA降解。 除研磨之外所有的抽提操作要温柔，DNA容易断裂 65℃水浴结束后，转移DNA溶液枪头剪去尖部 最后溶水禁止用反复吸打的方法助溶 取材尽量取幼嫩的叶片和组织 部分植物组织样品要去除多酚、多糖