pcr引物设计跟测序结果分析新.ppt

* * 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 引物过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。Tm值可 以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加 序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。） * 引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成 引物的5′ 端决定着PCR?产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 * 3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体； 发夹结构 引物二聚体 7. 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 8. 引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 引物同源性分析 用Blastn软件进行同源性比较 尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物 选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物 引物设计软件 Primer Premier 5.0 生物软件网下载 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer 如何使用Primer Premier 5.0 引物设计 一般引物设计 5’带酶切位点引物设计 巢式PCR引物设计 多重PCR引物设计 探针设计 引物评析 Primer Premier 5.0主要功能: 1、引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析 Primer Premier 5.0使用介绍 Preimer Premier 启动界面 Load sequence Sequence name Original sequence Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好 Choose a function 引物设计界面 引物设计界面 First you can design the primer manually Sense strand or anti-sense strand Useful information of the primer 引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围 引物长度 搜索结果 28对引物 引物分值 100分为满分 每对