bFF和PDGFBB作用内皮祖细胞促进血管形成及相关信号分子的分析.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 ·中文论著摘要 ·中文论著摘要· bFGF和PDGF．BB作用内皮祖细胞促进血管形成及相 关信号分子的研究 莉 再 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞， 即能循环、增殖并分化为成熟血管内皮细胞。自从1997年Asahara等首次从成人外 周血中分离出EPCs，并证实EPCs在生后的生理性和病理性血管新生中发挥重要作 用以来。EPCs介导的缺血组织血管再生(即治疗性血管新生)的研究已取得了较 大的进展。 正常情况下，骨髓中EPCs处于休眠状态，细胞因子可以促进EPCs动员、迁 移和分化并参与新血管形成。 EPCS的多向分化潜能是其最重要的生物学特征， EPCs具体向哪个方向分化及其调控机制是目前研究的热点。以往认为，内皮细胞 和平滑肌细胞来源于不同的前体细胞，但最近Yamashim和Lino等人的研究发现， 内皮细胞和平滑肌细胞可以来自同一前体细胞。而且有人在体内外的血管形成研 究中发现，成熟的内皮细胞可以转分化为血管平滑肌细胞。因此，这些均可为研 究EPCs的平滑肌分化潜能奠定一定的理论基础。 EPCs的分化受多种因素的影响，如缺氧、生长因子等，然后通过复杂的信号 通路调节细胞内多种基因的表达，最终引起EPCs的不同方向分化。血管内皮细 胞生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)主要通过对内皮细胞的直接丝裂 原作用促进新生血管的形成。PDGF．BB是目前研究其在血管形成和稳定方面比较 热点的一种生长因子，Betsholtz将PDGF-B和PDGFR-13基因敲出后发现：新形成 的血管缺乏周细胞／平滑肌细胞募集，这也说明PDGF．BB是血管成熟的重要因子。 目前人们就治疗性血管新生进行了广泛的研究，但是许多研究还只是注重新 生血管形成的多少而忽略了新形成血管的成熟性和稳定性。一个成熟、功能血管 网的形成需要内皮细胞和平滑肌细胞的相互作用，因为内皮细胞只能启动血管形 成过程，但不能完善新形成的血管，如果要想使新生血管成熟，则必须要有平滑 成过程，但不能完善新形成的血管，如果要想使新生血管成熟，则必须要有平滑 肌／周细胞的参与。因此，如果能分离出既能分化为内皮细胞又能分化为平滑肌细 胞潜能的干／祖细胞，同时这种干／祖细胞源性的内皮细胞和平滑肌细胞又具有明显 的增殖、迁移能力，这将为功能血管网的形成奠定雄厚的基础。 内皮祖细胞可以分化为内皮细胞并参与在治疗性血管生成中，这一现象早己 被许多实验所证实。通常生长因子与细胞表面的受体结合后，可以激活其下游分 子而发挥促细胞分化、增殖等作用。磷脂酶C吖(PLC吖)是生长因子信号通路的一 个重要信号中介，可被生长因子酪氨酸受体所激活，细胞外生长因子调节细胞生 长和分化主要通过其受体的酪氨酸激酶被活化而发挥作用的。通常人们认为 PLC-)是一个与细胞增殖和分化有重要关系的分子。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 通路是细胞发挥功能的重要信号转导通路。真核细胞中，已确定出ERK (p42／p44MAPK)，JNK／SAPK，p38MAPK及ERK5四条MAPK信号转导通路。其 中JNK和p38MAPK两条通路主要与细胞的应激和凋亡有关，而在细胞信号转导网 络中处于枢纽地位的ERK通路主要与细胞的增殖和分化密切相关。 基于EPCs的多向分化潜能以及bFGF和PDGF．BB在体内稳定新形成血管 的作用，本研究假设在bFGF和PDGF．BB分别诱导下，大鼠骨髓EPCs能向血管 内皮样细胞和平滑肌样细胞分化并参与成熟功能血管网的形成；同时通过检测这 二种细胞的增殖、迁移和形成血管的能力明确其能否成为新血管形成的种子细胞。 此外，探究bFGF和PDGF．BB介导内皮祖细胞分化、增殖的相关信号分子的表达， 为阐明内皮祖细胞的多向分化机制奠定坚实的理论基础。 实验方法 一、大鼠内皮祖细胞分离、培养及鉴定 采用Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离EPCs；收集 培养5d的EPCs，经免疫荧光染色，ACl33和vWF双染阳性细胞为正在分化的 EPCs。 二、EPCs的诱导培养及形态观察 EPCs被培养5天后。进行分组，对照组仅给20％胎牛血清的DMEM培养 2 基；bFGF 基；bFGF组在20％胎牛血清的DMEM培养基中添加bFGF(30ng／m1)；PDGF．BB 组在20％胎牛血清的DMEM培养基中添加PDGF．BB(40ng／m1)。共培养14天， 培养期间每2．3天换液并补充相应生长因子。每天观察细胞形态变化并采集图像。 三、免疫荧光检测EPCs分化标记物 EPCs在置有玻片的24孔板内被诱导到第4天和第8天时，换无血清培养基 孵育24h后，取出玻片，