蛋白质与核酸相作用的试验方法学研究.pptVIP

DNA-蛋白质相互作用研究实验 凝胶阻滞试验 DNaseI足迹试验 甲基化干扰试验 体内足迹试验 酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术 噬菌体展示技术 核酸适体技术 生物信息学方法 蛋白质芯片技术及纳米技术 一、凝胶阻滞试验（DNA迁移率变动试验DNA mobility shift assay） 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性 二、DNaseI足迹试验(DNaseI footprinting assay) 三、甲基化干扰试验 检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间的相互作用模式。 DMS化学干扰只能在G和A残基甲基化，不能使T和C甲基化。 故本实验为足迹实验的补充手段。 四、酵母单杂交技术 设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中; 将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中; 若文库蛋白与目的基因相互作用可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来. 注：这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA 片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白. 酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作用的研究。 八、染色体免疫沉淀技术Chromatin immunoprecipitation （ChIp） 细胞的甲醛固定 超声波断裂染色质 氯化铯等密度离心纯化交联的染色质 染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化 交联反应的逆转和DNA的纯化 染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定 目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步验证 * * 引言 1.很多细胞的生命活动涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质 结合因子之间的相互作用： DNA的复制和重组； mRNA的转录和修饰； 病毒的感染与增殖等 2.随着人类基因组测序工作的基本完成， 功能基因组学的研究显得尤为重要。而基因表达调控是 功能基因组学的一个重要研究领域。而要深入研究基因表 达调控的分子机制必须要研究DNA与蛋白质的相互作用。 3.在重组DNA技术发展以来，已相继分离到大量的具有重要生 物学意义的基因。在这种情况下科学工作者开始把自己的研 究兴趣逐渐转向DNA结合蛋白这一课题上。 1 原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电 极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如果此时DNA分子与某种蛋白质结合， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2 主要步骤及内容： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA） 同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质复合物。 将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。 应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置 不存在与DNA结合的蛋白质时 存在与DNA结合的蛋白质时 超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA ） 材料及试剂： 2X结合缓冲液： 20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、 poly(dI-dC) (5 mg/ml in TE)、 BSA (10 mg/ml)、 P32-标记探针 缓冲液C： 20 mM HEPES pH 7.9、25% glycerol、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、 0.5 mM 二硫苏糖醇、0.5 mM 苯甲基磺酰氟化物、0.2 mM EDTA 4%天然的聚丙烯酰胺凝胶(50 ml)：5 ml 40% 丙烯酰胺 (30:1)、2.5 ml 5X 四溴乙烷， 41.95 ml H20、0.5 ml 10% APS（过硫酸铵）、50 ml 四甲基乙二胺、0.25X 四溴 烷电泳缓冲夜。 填充染料： 0.2% 溴酚蓝、0.2%二甲本蓝、50% 甘油 操作步骤： 1.配置反应混合液：探针DNA (1 ng/ml) 0.1ml、 dH20 6.3 ml、2x 结合缓冲液 12.5 ml、BSA (10 mg/ml) 1.0 ml 、 poly(dI-dC) (5 mg/ml) 0.1ml、 2.在细胞提取物中加入缓冲液C至5 ml。 3.加10~15 mg上述溶液（￡ 5 ml)到反应混合物中，总体积应不大于25 ml。 4.在室温下培养2