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现代分子技术在食品检测中的应用 主要内容 1 PCR技术及其在食品检测中的应用 2 生物传感器及其在食品检测中的应用 3 基因芯片及其在食品检测中的应用 1 PCR技术及其在食品检测中的应用 PCR(polymerase chain reaction)技术 在1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。 检测常用的PCR技术 普通PCR技术 巢式、半巢式PCR技术：是一种提高灵敏度的方法。通过设计两对引物，其中一对引物结合的位点在另有所一对引物扩增的产物之中。 多重PCR技术：设计一组引物，在一个PCR反应过程中，对多个目的片段进行扩增。 实时荧光定量PCR(real—time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)又称荧光定量PCR：就在普通PCR仪的基础上配备了一个激发和检测的装置，实时监控PCR反应的进程。按照PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，加入相应的内对照，对待测样品中的目标基因进行准确定量。 多重PCR快速检测3种食源性致病菌 肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenie E coli，ETEC)，伤寒沙门菌(Salmonella typhi)，福氏志贺菌(Shigellaflexneri)是引起食源性疾病的常见3种病原体。 以肠毒性大肠埃希菌的编码大肠杆菌不耐热毒素(Heat labileenterotoxin，LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)的侵袭蛋白A(invasion proteinA，invA)、福氏志贺菌(s lla flexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H，ipaH)作为研究对象，建立一种稳定的、高敏感性和特异性的多重PCR体系。 具体步骤 细菌的培养和基因组DNA的提取 接种于EMB固体培养基上进行纯培养，挑一单个菌落复接种到30 ml相应增菌液内增菌，提取1 ml菌液用甘油保存于-80℃备用。 5000 r/min离心1 min，收集沉淀。 用细菌DNA提取试剂盒提取3种细菌DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度，分装数管，-20 ℃保存备用。 扩增的目的基因及引物设计 以肠毒性大肠埃希菌的编码I的基因，沙门菌的invA基因，志贺菌的ipaH基因为研究对象，根据Genbank中基因序列，应用Primer 5、0引物没计软件设计如下三对特异性引物。 单基因PCR扩增及特异性和敏感性分析 先对3种菌进行单独扩增，反应体系：模板DNA ，上、下游引物各1 ，dNTP ，Taq酶，10×Taq酶bufer，MgC12溶液，其余用无菌的去离子水补足。 PCR扩增条件：95℃变性3 min，94℃变性50 S、54℃退火50 S、72℃延伸50 s，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。 PCR产物在1.5％的凝胶上进行电泳。将3个PCR扩增产物进行回收，然后进行核苷酸序列测定，并与Genbank中发表的相应序列进行比较。 单管多重PCR的扩增反应体系 模板DNA 3 (3种菌各1μl )，引物3μl (3种引物各1μl )，dNTP共3μl，Taq酶1μl ，10×Taq酶bufer 5μl ，MgCl2溶液3μl ，其余用去离子水补足，总体积5μl。扩增条件同上。 PCR技术在食品检测中的应用 1 食品加工中外源DNA污染的检测 病原微生物的检测 掺假量的检测 2 转基因食品的检测 病原微生物的检测 常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。表1是一些应用PCR技术检测食物中病原微生物的成功例子。常见的食源性病原微生物的PCR检测试剂盒主要有BioCon—trol公司的肉毒梭菌、大肠杆菌0157：H7、李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名Probelia)和Qual—icon公司的大肠杆菌0157：李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名BAX)等。 大量研究表明，PCR技术在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度，而多数情况下则表现出更高的灵敏度，而且检测周期大为缩短。Aabo等对96个碎肉样品中自然污染的沙门氏菌进行检测，结果表明，一种PCR检测方法的检出率达到0.92，而由于样品本身所携带的菌群的干扰，传统方法漏掉了很多阳性样品，检出率仅为0.50。 掺假量的检测 由于DNA比蛋白质具有更高的热稳定性，与免疫学检测技术相比，利用PCR分析时不需要特异性抗体。特异性抗体的制备时间远远长于合成引物所需要的时间，所以RQ-PCR就成了检测食品掺假量的一