HBsAg的克隆抗体制备 表位分型及其应用分析.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 临床上，通过检测HBV血清标志物来辅助判断HBV感染与否，评价预后，治疗方案 和药物反应等。HBsAg是感染HBV后最早出现在血液中的标志物之一，通常在肝脏组织 产生生化指标异常或表现出黄疸症状前2．8周即可在血液中检测至IJHBsAg。因此，在血 液筛查和临床诊断中，HBsAg是检澳]HBV感染情况的首选指标。HBsAg由HBV的S基因 编码，根据HBsAg表面抗原决定簇的不同，可以将其分为不同亚型，主要包括：adw， adr，ayw和ayr。共同决定簇“a”存在于所有HBsAg，而a／y，w／r是两对互斥决定簇。不同 亚型具有明显的地理分布特点，并且与疾病的发生发展呈一定相关性，HBsAg r^l清型的 临床意义也是当前HBV研究的热点之一。在今后的HBV检测项目中，如果能够同时对 HBsAg_亚型进行鉴定，将为疾病的治疗方案和预后判断提供非常有价值的参考。共同决 定簇“a”存在于所有HBsAg中，因此成为免疫检测和疫苗设计的最佳靶点。 HBsAg的检测方法有很多，主要是基于抗原．抗体反应的夹心ELISA方法。该方法 具有成本低，操作简单，适用于大规模筛选等优点，是目前最为常用的检测方法。近年 来，相继有新的检测方法与技术问世，包括微粒子酶免疫分析，化学发光免疫分析等方 法。总体而言，特异性好且敏感性高的HBsAg单克隆抗体始终是各种方法与技术发展 的基础与前提。 本研究着眼于我国HBsAg检测水平与目前存在的问题，探讨了高敏感性高特异性 HBsAg单克隆抗体的制各与应用，同时对HBsAg亚型单抗的制备进行了初步探索，主 要包括以下三个方面的内容： 1．HBsAg共同决定簇“a’’单克隆抗体的制备。分别用抗原HBsAg．ay和HBsAg． ad免疫两组Balb／C小鼠，3次免疫之后检N d,鼠血清中HBsAg．ay或HBsAg．ad特异性 抗体效价。选择血清抗体效价较高的小鼠作为脾细胞来源，利用PEG作为融合剂将脾 细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合。经筛选获得阳性杂交瘤细胞，利用有限稀释法进一步分 选出分泌单一表位抗体的杂交瘤细胞，最终获得5株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。对 HBsAg．ay和HBsAg．ad抗原免疫获得的抗体进行交叉验证，筛选出共同决定簇“a”特 异性抗体3株，分别为命名为}}3．11．2，群3．16．1和柏．2．2。 2．共同决定簇“a，’特异性抗体的功能分析与应用研究。对2株亲和力较好的抗体进 行亚型鉴定发现，群3．11．2为IgG2a，K轻链：撑6．2．2为IgGl，K轻链。利用竞争 ELISA方法对各抗体进行表位鉴定。以特异性强、亲和力好为原则从中选择出一组不同 表位抗体，通过优化参数，确立了一个最佳的HBsAg检测体系：0．8 pg／mL群6．2．2包 被，l：10，000稀释撑3一“-2．HRP的检测效果最为理想。以市场上广泛认可的试剂盒阳性 对照品作为样本，检测本体系的有效性和灵敏性。进一步利用优选的一对撑6．2．2和撑3． 11．2-HRP建立夹心ELISA检测HBsAg方法，对正常人和乙肝患者血清标本进行检测， 并且与临床医院应用的检测方法进行比较，本研究中建立的体系表现出较好的实际应用 能力。 3．初步探索HBsAg血清型单克隆抗体的制备。在前期共同决定簇“a’特异性单抗 制备工作的基础上，探索HBsAg亚型单抗的制备。在第一部分中，HBsAg．ay和 HBsAg-ad抗原免疫筛选到共同决定簇 HBsAg-ad抗原免疫筛选到共同决定簇 a’特异性抗体的同时，还有一部分抗体能且仅能 与免疫抗原相互作用，在HBsAg．ay和HBsAg．ad之间无显著交叉反应。说明这些抗体 是特异性识别“Y或“d”表位的。以此为原理，筛选到2株HBsAg“Y’’特异性单克 隆抗体。 关键词 乙肝病毒表面抗原，单克隆抗体，酶联免疫吸附分析 II AbstractSerological Abstract Serological HBV markers are used in clinical practice of the prognosis and disgnosis of HBV infection and may be used for the guidance of Hepatitis therapy．Hepatitis B surface antigen(HBsAg)is one of the most common HBV infectious markers in the clinical field．耶1e marker could be detected in 2-8 weeks from the HBV infection to the onset ofj