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第五讲 分子生物学研究法 一、 重组DNA技术发展史上的重大事件 二、 基因操作的主要技术原理 三、 分子克隆技术 四、 DNA的Microarray 一、 重组DNA技术发展史上的重大事件 1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3.50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 1869? F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957? A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958? M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964?C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 1965?S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。 1966?M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973?H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977?F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。 1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。 1978?首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983?获得第一例转基因植物。 1984?斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986?GMO首次在环境中释放。 1988?J. D. Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。 1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--“Oncomouse”。 1992?欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb) 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 基因工程中常见的名词:遗传工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，重组DNA技术--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning。 基因工程的主要内容或步骤:1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 二、 基因操作的主要技术原理 1． 核酸的凝胶电泳(Agarose Polyacrylamide) ??? 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度