植物组织培养第章植物原生质体培养及细胞融合.pptVIP

第 七 章植物原生质体培养及细胞融合 什么是原生质体（Protoplast）？ 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 细 胞 1、机械分离（Machanical isolation） Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell. 2.7 原生质体分离过程 （一步法——以烟草叶片为例） 第一步：预处理即对烟草植株限制供水。 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外 表皮切成4cm的小块。 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6。 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理8~10小时 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此2~3次、得原生质体。 （二） 原生质体纯化 酶处后得到混合液包括： 原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。 原生质体纯化方法： 离心沉淀法 漂浮法 接口法 1、离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。 步骤： 第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步：离心（500~1000r/min离心5~6min）。 第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新 悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生质 体。 洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇， 10mmol/LCaCl2 ` H2O, 0.7mmolK H2PO4, 洗涤液pH： 5.6 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 洗涤液：3%蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇+ 1480mg/LCaCl2 2 H2O 。或11%~23%的蔗糖溶液。 （四）影响原生质体数量和活力的因素 1、供试材料 2、酶的种类、组合和酶解时间 3、渗透压稳定剂 4、质膜稳定剂 5、pH值 （二）影响原生质体培养的因素 1、原生质体的活力 2、起始密度 3、渗透压稳定剂 4、培养基成分 5、培养条件 6、植物材料和基因型 2、成 就 1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。 1975年柑桔原生质体培养成功； 现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。 番茄+马铃薯？ 3、融合方法 异硫氰酸荧光素（FITC） 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分别发出绿色和红色 1）生产无籽柚 柚为我国特色水果，栽培面积已达100万亩，其中50%为沙田柚 沙田柚品质佳，但不足在于种子多，最 多可达120粒 能能否生产无籽或少籽柚？ 2）筛选商用品种 5、体细胞杂种的鉴定 形态学 细胞学 遗传标记 5-1 形态学 比较再生植株与融合亲本在形态上的异同：株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色。 5-2、细胞学 染色体形态和数目的比较 5-3、遗传标记 SSR RFLP 同工酶 RAPD AFLP 分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质 再生植株同时具有亲本的带； 再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，在另一种情况下具有另一个亲本的带。 RAPD带型 RAPD带型 6、体细胞杂种的应用 培养抗病的新品种 野生种的抗逆性转移到栽培种（马铃薯，烟草）果树上，砧木，接穗 合成新材料 远缘杂交，科间/属间，个体的育性问题。 转移细胞质基因控制的性状。 作砧木应用 果树砧木是处于嫁接口以下的地下部分，砧木本身的果实性状对于地上部分的果实无什么影响，砧木要求抗性好，与地上部分亲和。 应用实例： 1.1 饲养层培养 方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。