中国人作肥胖基因大肠杆菌中的表达.pptVIP

肥胖基因概述及发现 肥胖基因(Obese gene) 是近几年克隆的一个新基因 , 该基因产物 ———瘦蛋白 (leptin)，是由脂肪组织产生并分泌167个氨基酸组成的多肽 ,分泌蛋白分子量约16 kb, 是反映体内脂肪组成及体内脂肪含 量和调节体重的重要信号因子 1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性基因突变，命名为肥胖基因(Obese gene），它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2型糖尿病，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠血液循环相连，肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆(Positional cloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，为揭开肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量。实验表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化，恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用〔4，5〕。 脂肪组织：取自男性中国人胃切除手术病人的正常大网膜，液氮冻存备用 新鲜脂肪组织立即置于液氮冻存。取1克冻存的大网膜脂肪组织，剪成数小块，在总量为10ml的Trizol液中高速匀浆1分钟。将组织匀浆液吸入50ml离心管，于室温下静置5分钟，加入2ml氯仿，剧烈振摇混匀后，室温静置3分钟，然后11 000g 4℃离心15分钟，将上层无色水相吸入一新管，加入5ml异丙醇，室温孵育10分钟，然后11 000g 4℃离心10分钟，75%乙醇洗涤RNA沉淀，7 500g 4℃离心5分钟，稍干燥后用400μl 无RNase的双蒸水溶解。（冷冻-离心-保存） * * * * * * * * * * * * * * 中国人肥胖基因的克隆、 序列分析及在大肠杆菌中的表达 资料来源：中华内分泌代谢杂志 1998年第4期第14卷 临床研究 作者：周炜　缪为民　周丙荣　王立明　陈志辉　焦炳华 单位：200433 第二军医大学微生物学教研室；复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室 RNA抽提 反转录PCR（PCR扩增） 根据已报道的序列设计引物，即将编码成熟肽的第二个密码子CCC 转变为大肠杆菌常见密码子 CCG: P1：5’-AAC GAA TTC ATG GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA-3’ P2：5’-TTT GGA TCC TCA GCA CCC AGG GCT GCG GTC-3’ 以提取的RNA与P2引物70℃共同孵育5分钟后置冰浴。第一链cDNA合成反应体系为200u AMV反转录酶，5μl 5×缓冲液，1μl RNasin，2μg RNA，四种dNTP(各250μmol/L)。100pmol/L P2引物，总体积25μl,37℃，1小时。取5μl cDNA产物进行PCR扩增，反应体系为5u Taq酶，5μl 10×缓冲液，四种dNTP(各250μmol/L)，P1和P2引物各100pmol/L，总体积50μl,94℃ 5分钟后行PCR扩增，循环条件为94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35循环后72℃延伸10分钟，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。 肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析 　　将肥胖基因的RT-PCR产物电泳纯化后行EcoR I和BamH I双酶切，与同样经EcoRI和BamH I双酶切的pUC19质粒载体连接。连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，LB培养基培养过夜。以IPTG/X-Gal体系筛选白色菌落，碱法快速抽提质粒，酶切后电泳鉴定重组质粒。用ABI 377荧光自动测序仪进行DNA顺序分析。 肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析 　用测序载体pUC19顺利地对肥胖基因PCR产物进行了克隆。通过ABI 377荧光自动化测序，证明其序列与报道的白种人完全一致。 肥胖基因的原核表达 　　用EcoR I和Sal I将肥胖基因从pUC19载体上切下，克隆入六聚组氨酸融合表达载体pPROEX HTa 质粒(图1)。pPROEX HTa重组质粒转化大肠杆菌（E.coli） DH5α菌株并经酶切电泳鉴定。接种重组质粒的单菌落于3 ml LB中，37℃振摇培养过夜，按1%比例转接至30 ml LB中，37℃振摇培养3小时，使OD600约等于0.3～0.4，加入IPTG至终浓度为0.4mol/L，继续培养3小时，离心收集菌体，进行SDS电泳。 示意图 将肥胖基因克隆入pPROEX HTa六聚组氨酸融合表达载体，获得表达的蛋白分子量为17.5 Kd，表达量高达20%左右。 用