miR200族在鱼类精巢和胚胎发育中的表达和功能研究.docxVIP

华中农业大学2016届博士研究生学位论文2．10．1真核表达质粒构建 华中农业大学2016届博士研究生学位论文 2．10．1真核表达质粒构建 ．25 2．10．2启动子质粒构建 25 2．10．3 MicroRNA靶基因验证质粒构建 25 2．10．4载体点突变 ．26 2．11体外转录合成mRNA 一26 2．12显微注射 27 2．13胚胎整体原位杂交(WISH) 27 2．14胚胎凋亡检测 29 2．14．1 Terminal transferase dUTP nick end labeling(TUNEL) 。29 2．14．2活胚胎吖啶橙(Acridine orange，AO)染色 ．30 2．14．3流式细胞技术(fluorescenceactivated cell sorting，FACS) 30 2．1 5蛋白实验 3 l 2．15．1胚胎总蛋白提取 ．3l 2．15．2 Western blot分析 3l 2．16 293T细胞实验 32 2．16．1细胞传代培养 32 2．16．2细胞冻存保藏及冻存细胞的复苏 32 2．16．3细胞转染及荧光素酶活性分析 33 2．17数据分析 34 第三章结果与分析 ．35 1黄颡鱼性腺miRNA的转录组分析 35 1．1 RNA质检结果 35 1．2测序数据产出总览 35 1．3各类RNA数据库比对结果 ．36 1．4黄颡鱼性腺miRNAs的表达模式 37 1．4．1保守miRNAs和新miRNAs的鉴定 37 1．4．2性别相关miRNAs的表达分析 ．38 1．4．3精巢发育相关miRNAs的表达分析 40 1．5荧光定量验证结果 41 1．6一龄XY和YY精巢的组织学差异及miR．200家族的表达差异 ．43 2 miR．200家族在斑马鱼生长发育方面的功能研究 一46 2．1 miR．200家族成员在胚胎发育时期的表达模式 46 2．2 miR．200家族成员调控生长激素内分泌轴的基因表达 47 2_3 miR．200调控斑马鱼胚胎的正常体长生长 50 2．4胚胎发育时期过表达miR．200抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡 52 2．5生长激素内分泌轴的多个关键基因是miR．200s的直接靶基因 54 2．6生长激素依赖P53调控miR．200s的表达 56 2．7 miR．200启动子中潜在的p53结合位点与启动子活性相关 58 第四章讨论 ．．60 l黄颡鱼性腺miRNAs表达模式及miR．200家族参与精巢发育 60 2 p53／miR．200s与GH／IGF轴反馈调控斑马鱼胚胎大小 ．．62 参考文献 65 附录 79 致{射 80 IT 万方数据 miR-200家族在鱼类精巢和胚胎发育中的表达和功能研究摘要 miR-200家族在鱼类精巢和胚胎发育中的表达和功能研究 摘要 MicroRNAs(miRNAs)在脊椎动物的性别分化和性腺发育过程中发挥重要 调控作用。黄颡鱼作为我国性别异形经济鱼类的代表，其雌、雄性腺的miR．NAs 表达谱均未见报道，此外黄颡鱼性腺发育的分子机制仍不清楚。本研究首先通过 Solexa深度测序技术检测了3种类型的黄颡鱼性腺(XX型雌鱼卵巢，XY型雄 鱼精巢以及YY超雄鱼精巢)。测序数据产生了384个保守的miRNA s和113个 潜在的新miRNAs，其中分别有23，30和14个miRNAs在XX卵巢，XY精巢 以及w精巢中特异表达。研究发现黄颡鱼性腺中一些性别差异表达的miRNAs， 在其他脊椎动物中也呈现出相似的性别相关的表达模式。我们还观察到miR．200 家族成员(包括miR．141和miR．429)在XY精巢的表达水平均比YY精巢的低。 组织学分析显示W超雄鱼的精巢比XY雄鱼的精巢成熟度要高，因为YY超雄 鱼的精巢有更大的精小囊，且精小囊中有更多的精细胞