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第8章 酶分子的化学修饰 Chemical Modification of Enzyme Molecule 酶的活性中心 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的基本原理 酶化学修饰的方法学 酶化学修饰的种类 修饰酶的化学性质 酶化学修饰的应用和局限性 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。 1. 聚乙二醇的修饰反应 聚乙二醇（PEG）：线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，可消除酶分子的抗原性，广泛用于酶的修饰。 PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，产生许多有用的性质，如可在广泛的pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降等。 修饰方法：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均嗪法、羰二亚胺法、重氮法。 2. 糖类的修饰反应： (1) 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应 右旋糖苷：? -葡萄糖通过? -1, 6-糖苷键连接而成，双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。 修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法。 (2) 糖肽（Glycopeptide)的修饰反应: 糖肽：人纤维蛋白或? - 球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反应。 修饰方法：2,3-异氰酸甲苯活化法、戊二醛法。 (3) 聚乳糖修饰反应： 聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。 3. 其他大分子多聚物的修饰反应 (1) 聚N - 乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量为10,000的PVP，经过开环水解活化后，与酶结合。 (2) 聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。 (3) 聚丙烯醇(PAA):用分子量为250,000的PAA，经过N - 羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。 (4) 聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98,000的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。 (5) 聚氨基酸：用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。 4. 天然大分子对酶的修饰反应 (1) 肝素：由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为20000，是一种含硫酸酯的黏多糖。 经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。 修饰方法：羰二亚胺法、三氯均嗪法、溴化氰法 (2) 人血清白蛋白：相对分子质量大 修饰方法：戊二醛法、羰二亚胺法、活性酯法 带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）： 赖氨酸 (Lysine, Lys, K), 精氨酸 (Arginine, Arg, R), 组氨酸 (Histidine, His, H) 带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）： 天冬氨酸 (Aspartic acid, Asp, D), 谷氨酸 (Glutamic acid, Glu, E) 1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。 可作用基团： 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 修饰剂：2, 4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应 2) 酰基化反应 试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr） 酰基化反应 3) 氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基、甲硫基、吲哚基、咪唑基、酚基等。 还原剂：2-巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。 （四）固定化修饰（共价偶联法） 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。 （一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）P285 蛋白主链修饰利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 采用酶法 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。