酵母双杂交系统筛选dnd1相互作用蛋白-生收理学专业毕业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘 摘 要 目的：应用酵母双杂交系统筛选小鼠胚胎cDNA文库中与DNDl 相互作用的蛋白，进一步明确Dndl的生物学功能，为探明Dndl的 信号传导通路及阐明Dndl基因在TGCT发生中的分子机制奠定基 础。 方法：@PCR法从胚胎cDNA文库扩增小鼠Dndl基因编码区序 列，构建重组质粒pMDl8．T-Dndl，再将Dndl基因片段亚克隆至诱 饵载体pDBLeu并对重组诱饵质粒pDBLeu．Dndl进行酶切及测序鉴 定。②将诱饵质粒转化酵母宿主菌，卢．半乳糖苷酶滤纸法检测其对 报告基因LacZ的激活作用；观察转化后酵母菌的生长状态及增殖速 度，分析其对宿主菌的毒性作用。③确定合适的3AT浓度，而后将 文库质粒pPC86．Library转化含诱饵质粒的酵母菌并涂布于营养缺陷 培养基进行三轮筛选并用卢．半乳糖苷酶滤纸法分析其LacZ表型。④ 提取阳性克隆酵母质粒，电转化E．coli DHl0B，利用Amp‘LB平板筛 选文库质粒转化子，提取质粒，PCR确定文库质粒片段大小，并检测 文库质粒AD．Library自身激活作用，最后文库质粒转化含诱饵质粒 的酵母菌验证蛋白相互作用。对最终确定的阳性克隆文库质粒测序并 对测序结果进行初步分析。 结果：①酶切和测序分析表明Dndl基因序列及读码框均正确。 ②诱饵质粒pDBLeu．Dndl成功转化酵母菌MaV2