实验——时基因组抽提.pptVIP

细菌总DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳 实验原理——基因组抽提 本实验采用小规模快速制备总DNA，其基本原理是：在碱性条件下，用表面活性剂SDS将细菌细胞壁破裂，然后用高浓度的NaCl沉淀蛋白质等杂质，经过苯酚抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的总DNA。 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。 实验原理——琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1, 3连接的吡喃型β-D-半乳糖和1, 4连接的3, 6脱水吡喃型?-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104-105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。 对于同种DNA分子，胶浓度越高，电泳速率越慢。 DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH = 8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。 实验原理——琼脂糖凝胶电泳 在相同的电泳条件下，影响DNA分子泳动的因素主要是DNA分子特性： DNA分子大小。DNA分子越大，在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 DNA分子构型。对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。 溴化乙锭（Ethidium Bromide），简称EB，是电泳中的常用的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。 实验原理——琼脂糖凝胶电泳 电泳中，DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，其主要作用如下： 一般上样缓冲液中含10 mmol/L的EDTA以螯合Mg2+，防止电泳过程中DNA被DNase降解。 一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，和样品混合后用于增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内。 一般上样缓冲液中加入溴酚蓝，使样品呈色，使加样操作更方便，同时溴酚蓝的泳动速率较快（约与300 bp的线状双链DNA相同），可用于监测电泳的行进过程。 实验原理——琼脂糖凝胶电泳 目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。电泳时样品和Marker在平行的加样孔内加入，同时进行电泳，可以根据电泳结果看出样品中DNA的大小。 操作步骤——细菌总DNA的提取 菌体培养：接种大肠杆菌K12s于LB液体培养基，于37℃振荡培养16－18 h，获得足够的菌体。 菌体收集：取1.5 mL培养液于1.5 mL离心管中，12000 rpm离心30 s，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。 裂解菌体：向每管加入200 μL裂解缓冲液，用微量移液器吸头强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。 向每管加入66 μL 5mol/L NaCl，充分混匀后，12000 rpm离心10 min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。 将上清转移到新离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1 v/v/v），充分混匀后，12000 rpm离心3 min。 小心取出上清，用0℃的两倍体积的无水乙醇沉淀，12000 rpm离心5 min，弃上清液。 沉淀用400 μL 70％的乙醇洗涤两次。每次12000 rpm离心2 min。 用电吹风小心吹干，用50 μL无菌双蒸水溶解DNA。 操作步骤——琼脂糖电泳 制胶（演示）：称取适量琼脂糖粉末，加入TAE缓冲液配成1.4%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，加入少许EB染液混合，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置一段时间，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳，在凝胶板上即形成相互隔开的加样孔。把凝胶板从制胶槽中取出放入电泳槽，再往电泳槽中加入1 ? TAE直到液面没过凝胶并超过凝胶1－2 mm为止。 加样：用微量移液器取5?L DNA Marker，小心地加到最靠边上的加样孔内。另取10?L样品，和少量的上样缓冲液混匀后小心地加到同一凝胶板上相邻的加样孔中。每加完一个样品，换一个吸头。 电泳：接通电源，DNA样品由负极往正极泳动，应使靠近加样孔的一端为负。维持恒压80 V，电泳0.5－1 h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶